Суть метода – выделение чистой культуры микроба – возбудителя из патологического материала, подробное изучение его морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических свойств с целью последующей идентификации возбудителя. При осуществлении бактериологического метода исследования выделяют 4 этапа.
А. Учитывая данные, полученные при бактериоскопическом исследовании, осуществляется выбор максимально эффективных питательных сред, на которых с наибольшей долей вероятности удастся получить рост культуры предполагаемых микробов – возбудителей.
Б. Производится посев исследуемого материала на ряд питательных сред: жидких и плотных, универсальных, элективно-селективных, дифференциально-диагностических. При этом посев на чашки Петри с плотными питательными средами производится бактериологической петлей штрихом с целью обеспечить возможность получения роста изолированных друг от друга колоний микробов (можно пользоваться также способом Дригальского или другим методом разобщения культур микроорганизмов).
А. Изучаются культуральные свойства выросших на питательных средах микроорганизмов; производится отбор подозрительных колоний. Следует подчеркнуть, что отбор подозрительных колоний – самый ответственный и трудный этап работы. Он основан, прежде всего, на определении характерных особенностей колоний микробов, но зачастую это не позволяет дифференцировать колонии микробов отдельных видов и приходится дополнительно изучать морфологию микробов в мазках из подозрительных колоний, особенности роста микроорганизмов на дифференциально-диагностических средах и т.д. Выделение чистых культур бактерий и их изучение можно осуществлять, проводя предварительный посев на жидкие среды накопления, но при этом затрачивается дополнительное время исследования.
Б. Из подозрительных колоний готовится бактериологический мазок, окрашивается по Граму и микроскопируется (устанавливается идентичность микроорганизмов с изученными при микроскопическом исследовании на 1-ом этапе).
В. Из оставшейся части подозрительной колонии производится пересев культуры на скошенный мясо-пептонный агар (можно использовать и другие питательные среды, на которых предполагается хороший рост выделенных микроорганизмов). Цель, накопления чистой культуры микроба – предполагаемого возбудителя заболевания, т.к. на следующем этапе исследования потребуется много микробной массы.
У предполагаемого возбудителя изучаются сахаролитические свойства (производится посев на среды пестрого ряда среды Олькеницкого, Ресселя и др.), протеолитическая активность (посев на желатин, молоко по Тукаеву, определение образования индола и сероводорода при росте на мясо-пептонном бульоне). Исследуется чувствительность выделенных культур к антибиотикам (чаще методом стандартных бумажных дисков, реже – методом серийных разведений). Производится серотипирование в реакции агглютинации на стекле с групповыми и типовыми диагностическими сыворотками; фаготипирование со стандартными диагностическими бактериофагами. Для идентификации в некоторых случаях изучаются факторы патогенности у бактерий.
Производится учет результатов проведенных исследований. На основании сопоставления выявленных у микроорганизмов свойств (морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических и т.д.) осуществляется идентификация микробов. Выдается окончательный ответ с результатами бактериологического исследования, где указывается вид возбудителя (иногда – его серотип, биовар, фаготип) и его чувствительность к антибиотикам.
Довольно часто для получения достоверных результатов выдаче ответа предшествуют, биологический, аллергологический или другие методы исследования.
Достоинства бактериологического метода диагностики : высокая достоверность результатов исследования; возможность получения дополнительных данных о чувствительности выделенных возбудителей к антибиотикам; возможность проведения эпидемиологических исследований.
Бактериологический метод исследования. Выделение чистой культуры аэробных бактерий (1-2 этапы)
1. Суть бактериологического метода
3. Методы получения изолированных колоний
4. Методы получения чистой культуры
1. Провести первичный посев методом Коха и Дригальского
2. Выделить чистую культуру
План работы:
1. Бактериологический метод исследования
2. Этапы бактериологического метода
3. Понятие: чистая культура, штамм, колония
4. Методы получения изолированных колоний
5. Методы получения чистой культуры аэробных бактерий
Основным методом лабораторной диагностики инфекционных болезней является бактериологический метод. Суть бактериологического метода заключается в выделении возбудителей из исследуемого материала и его идентификации (определения рода, вида, разновидностей).
Бактериологический метод позволяет определить:
1. Вид возбудителя и поставить диагноз заболевания
2. Антибиотики, убивающие возбудителя и назначить соответствующее лечение
3. Фаговары и серовары возбудителя для выявления источника инфекции
Первый этап - первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Первичный посев проводят на накопительные среды и ДДС (чашечные среды).
Второй этап - характеристика изолированных колоний и получение из них чистой культуры путем пересева на скошенный столбик основной среды.
Третий этап - идентификация чистой культуры - определение рода, вида, разновидностей возбудителя, определение антибиотикочувствительности, определение фаговаров.
Культура микроорганизмов - это бактерии, выросшие на питательных средах. Чистая культура - это бактерии одного вида, выросшие на питательных средах. Внутри вида встречаются разновидности, отличающиеся по одному признаку:
1. Морфовары - отличаются по морфологии
2. Хемовары - отличаются по биохимическим свойствам
3. Серовары - отличаются по антигенным свойствам
4. Фаговары - отличаются по чувствительности к фагам
Чистая культура необходима для проведения идентификации, определения сероваров, фаговаров, чувствительности к антибиотикам. Штамм - это бактерии одного вида, выделенные из конкретного источника (река Волга, больной Иванов и т. д.). Колония - видимое скопление бактерий одного вида, образующееся при размножении одной бактериальной клетки на плотной питательной среде.
Первый этап исследования - первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Перед первичным посевом проводят микроскопию исследуемого материала. Исследуемый материал как правило содержит смесь различных бактерий, в том числе и возбудителей болезни. Для выделения возбудителя необходимо получить изолированные колонии (бактерии одного вида) путем подбора питательной среды и специальными методами посева.
Существует два метода получения изолированных колоний:
1. Метод Дригальского
Бактериологический метод исследования (БЛМИ) – метод, основанный на выделении чистых культур бактерий с помощью культивирования на питательных средах и их идентификации до вида на основании изучения морфологических, культуральных, биохимических, генетических, серологических, биологических, экологических характеристик микроорганизмов.
Бактериологическую диагностику инфекций проводят, используя стандартные диагностические схемы, утвержденные Министерством здравоохранения.
Чистая культура – бактерии одного вида, выращенные на питательной среде, свойства которых находятся в процессе изучения.
Штамм – идентифицированная чистая культура микроорганизмов одного вида, выделенная из определенного источника в определенное время. Штаммы одного вида могут несущественно отличаться биохимическими, генетическими, серологическими, биологическими и др. свойствами, а также местом и временем выделения.
Цели БЛМИ:
1. Постановка этиологического диагноза: выделение чистой культуры микроорганизмов и её идентификация.
2. Определение дополнительных свойств, например, чувствительности микроорганизма к антибиотикам и бактериофагам.
3. Определение количества микроорганизмов (важно в диагностике инфекций, вызываемых УПМ).
4. Типирование микроорганизмов, т. е. определение внутривидовых различий на основании изучения генетических и эпидемиологических (фаговаров и сероваров) маркёров. Это используется в эпидемиологических целях, т. к. позволяет установить общность микроорганизмов, выделяемых от разных больных и из разных объектов внешней среды, в различных стационарах, географических регионах.
БЛМИ включает несколько этапов, различных для аэробов, факультативных анаэробов и облигатных анаэробов.
I. Этапы БЛМИ при выделении чистой культуры аэробов и факультативных анаэробов.
Этап.
А.Забор, транспортировка, хранение, предварительная обработка материала. Иногда до посева проводят селективную обработку материала с учетом свойств выделяемого микроорганизма. Например, перед исследованием мокроты или другого материала на присутствие кислотустойчивых микобактерий туберкулеза, материал обрабатывают растворами кислот или щелочей.
Б. Посев в среду обогащения (при необходимости).Его проводят, если в исследуемом материале содержится малое количество бактерий, например, при выделении гемокультуры. Для этого кровь, взятую на высоте лихорадки в большом объёме (8–10 мл у взрослых, 4–5 мл у детей) засевают в среду в соотношении 1:10 (для преодоления действия бактерицидных факторов крови); посев инкубируют при температуре 37 0 С 18-24 ч.
В. Микроскопия исследуемого материала. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микроскопируют. Оценивают присутствующую микрофлору, ее количество. В ходе дальнейших исследований должны быть выделены микроорганизмы, присутствовавшие в первичном мазке.
Г. Посев на питательные среды с целью получения изолированных колоний. Производят посев материала петлёй или шпателем методом механического разобщения на чашку с дифференциально-диагностической или селективной средой с целью получения изолированных колоний. После посева чашку переворачивают дном кверху (чтобы избежать размазывания колоний капельками конденсационной жидкости), подписывают и помещают в термостат при температуре 37 0 С на 18-24 ч.
Следует помнить, что при посевах и пересевах микробных культур внимание работающего должно быть обращено на соблюдение правил асептики для предупреждения контаминации питательных сред и предупреждения заражения окружающих и самозаражения!
В случае инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, где имеет значение количество присутствующих микроорганизмов в патологическом материале, делают количественный посев материала, для чего предварительного готовят ряд 100-кратных разведений материала (обычно 3 разведения) в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия в пробирках. После чего по 50 мкл каждого разведения высевают на питательные среды в чашках Петри.
Этап.
А. Изучение морфотипов колоний на средах, их микроскопия. Просматривают чашки и отмечают оптимальную питательную среду, скорость роста, характер роста микроорганизмов. Для изучения выбираютизолированные колонии, расположенные по ходу штриха, ближе к центру. Если вырастает несколько типов колоний – каждый исследуется в отдельности. Оценивают признаки колоний (табл. 7). При необходимости чашки с посевамипросматривают через лупу или с помощью микроскопа с объективом малого увеличения и суженной диафрагмой. Изучают тинкториальные свойства отличающихся морфотипов колоний, для этого из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму или другими методами, микроскопируют и определяют морфологию чистоту культуры.При необходимости ставят ориентировочную РА на стекле с поливалентными сыворотками.
Б. Накопление чистой культуры. Для накопления чистой культуры изолированные колонии всех морфотипов пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой и инкубируют в термостате при +37 0 С (такая температура оптимальна для большинства микроорганизмов, но может быть и другой, например, для Campylobacterium spp. – +42 0 C, Candida spp. и Yersinia pestis – +25 0 C).
В качестве среды накопления для энтеробактерий обычно используют среду Клиглера.
Состав среды Клиглера: МПА, 0,1% глюкозы, 1% лактозы, реактив на сероводород (сернокислое железо + тиосульфат натрия + сульфит натрия), индикатор феноловый красный. Изначальный цвет среды малиново-красный, среда «скошена» в пробирках: имеет столбик (2/3) и скошенную поверхность (1/3).
Посев в среду Клиглера производится штрихом по поверхности и уколом в столбик.
Этап.
А. Учет роста на среде накопления, оценка чистоты культуры в мазке по Граму.Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нём в разных полях зрения обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Однако в случае выраженного плеоморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры могут встречаться одновременно клетки с различной морфологией.
Если в качестве среды накопления использовали индикаторную среду Клиглера, то оценивают изменения ее цвета в столбике и скошенной части, по которым определяют биохимические свойства: ферментацию глюкозы, лактозы и продукцию сероводорода. При разложении лактозы желтеет скошенная часть среды, при разложении глюкозы – желтеет столбик. При образовании CO 2 в процессе разложения сахаров образуются газовые пузырьки или разрыв столбика. В случае продукции сероводорода отмечается почернение по ходу укола из-за превращении сульфата железа в сульфид железа.
Характер изменения цвета среды Клиглера (рис. 23) объясняется неодинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ и образования щелочных продуктов в аэробных (на скошенной поверхности) и анаэробных (в столбике) условиях.
В аэробных условиях на скошенной поверхности происходит более интенсивное щелочеобразование, чем в столбике среды. Поэтому при разложении глюкозы, присутствующей в среде в небольшом количестве, образующаяся на скошенной поверхности кислота быстро нейтрализуется. В то же время при разложении лактозы, присутствующей в среде в высокой концентрации, щелочные продукты не способны нейтрализовать кислоту.
В анаэробных условиях в столбике щелочные продукты образуются в ничтожном количестве, поэтому здесь выявляется ферментация глюкозы.
Рис. 23. Индикаторная среда Клиглера:
1 – исходная,
2 – с ростом E. coli,
3– с ростом S. paratyphi B,
4 –с ростом S. typhi
E. coli разлагают глюкозу и лактозу с газообразованием, не продуцируют сероводород. Они вызывают пожелтение столбика и скошенной части с разрывами среды.
S. paratyphi разлагают глюкозу с газообразованием, лактозоотрицательны. Они вызывают пожелтение столбика с разрывами, скошенная часть не изменяет цвет и остается малиновой. При этом S. paratyphi B продуцируют сероводород (по ходу укола появляется черная окраска), S. paratyphi A сероводород не продуцируют.
S. typhi разлагают глюкозу без газообразования, лактозоотрицательны, продуцируют сероводород. Они вызывают пожелтение столбика без разрывов, скошенная часть не изменяет цвет и остается малиновой, по ходу укола появляется черная окраска.
Shigella spp. глюкозопозитивны, лактозоотрицательны, не продуцируют сероводород. Они вызывают пожелтение столбика (с разрывами или без них в зависимости от серовара), скошенная часть не изменяет цвет и остается малиновой.
Б. Окончательная идентификация чистой культуры (определение систематического положения выделенного микроорганизма до уровня вида или варианта) и определение спектра чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.
Для идентификации чистой культуры на этом этапе изучают биохимические, генетические, серологические и биологические признаки (табл. 8).
В рутинной лабораторной практике при идентификации нет необходимости изучать все свойства. Используютинформативные, доступные, простые тесты, достаточные для определения видовой (вариантной) принадлежности выделенного микроорганизма.
Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.
Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.
Бактериологический метод исследования включает:
1. посев исследуемого материала в питательные среды
2. выделение чистой культуры
3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).
Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:
I этап (работа с нативным материалом)
Цель: получение изолированных колоний
1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре
2. Подготовка материала к исследованию
3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний
4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов
II этап
Цель: получение чистой культуры
1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).
2. Микроскопическое изучение изолированных колоний
3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).
4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.
III этап
Цель: идентификация выделенной чистой культуры
1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:
· морфология и тинкториальные свойства
· культуральные свойства (характер роста на питательных средах)
· биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)
· серологические свойства (антигенные)
· вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)
· патогенность для животных
· фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)
· чувствительность к антибиотикам
· другие индивидуальные свойства
IV этап (Заключение)
По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре
Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.
При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.
Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.
Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.
Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Так как материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии, очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет; полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).
Таблица 11. Схема изучения колоний
| № | Признак | Возможные характеристики колоний |
| 1. | Форма | Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая |
| 2. | Величина, мм | Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм) |
| 3. | Характер поверхности | Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая |
| 4. | Цвет | Бесцветные, окрашенные |
| 5. | Прозрачность | Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные |
| 6. | Характер краев | Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые |
| 7. | Внутренняя структура | Гомогенная, зернистая, неоднородная |
| 8. | Консистенция | Вязкая, слизистая, крошковидная |
| 9. | Эмульгирование в капле воды | Хорошо, плохо |
Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.
Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют небольшое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).
Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для этого из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).
При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые культуры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.
Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического положения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаимного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия культивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием промежуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).
Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.
Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают пробку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.
Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут пробирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.
При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°С на сутки.
Заключение
Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.
Возможности использования бактериологического исследования при глазных заболеваниях ограничены пределами доступности патологического очага. При расположении его в заднем отрезке глаза получить материал для исследования часто очень Трудно и возможность бактериологической диагностики в таких случаях, естественно, исключается. Основная область применения бактериологической диагностики в глазной практике — это заболевания наружного отдела глаза, а также проникающие ранения, при которых материал для исследования может быть получен во время хирургической обработки раны или при извлечении инородного тела. Вообще надо заметить, что при оперативных вмешательствах круг возможностей для получения бактериологического материала значительно расширяется.
Получение материала для исследования
Для получения материала из конъюнктивального мешка пользуются платиновой петлей (при ее отсутствии можно использовать петлю, изготовленную из нити спирали электроплитки, или другой инструмент (стеклянная палочка, шпатель и т. п.), которую предварительно стерилизуют прокаливанием в пламени спиртовой горелки. Оттянув нижнее веко, остывшей петлей захватывают комочек конъюнктивального отделяемого из глубины нижнего свода. При этом необходимо избегать прикосновения петли к коже и краям век, чтобы не занести в материал постороннюю микрофлору. Брать материал желательно до начала лечения и в утренние часы, когда отделяемое бывает более обильным. При отсутствии слизи и гноя (например, при исследовании здоровой конъюнктивы перед операциями) следует использовать слезную жидкость или слегка поскоблить поверхность соединительной оболочки (по Линднеру). Но лучше в таких случаях применить методику Элыннига: впустить в конъюнктивальный мешок из пастеровской пипетки одну каплю стерильного физиологического раствора или бульона и через несколько секунд отсосать эту каплю.
По тем же общим правилам получают материал из слезного мешка, выдавливая его содержимое, и с края века при язвенном блефарите, сняв предварительно корочку с язвы.
Большая осторожность требуется при взятии материала с роговой оболочки, особенно при наличии ползучей язвы роговицы. Петлю (или другой тупой инструмент) следует направлять косо к поверхности язвы и брать материал из прогрессирующего края ее. При этом необходима анестезия (3 капли 1% дикаина) и фиксация глазного яблока.
В качестве материала для исследования при проникающих ранениях глаза можно использовать отделяемое раны (если оно имеется), захватив его петлей или марлевым тампоном, пунктат передней камеры или извлеченное инородное тело, которое помещают в стерильную пробирку с 1-2 мл физиологического раствора. После встряхивания пробирки раствор используют для исследования.
Из передней камеры материал для исследования может быть получен с режущего инструмента во время парацентеза или посредством пункции. После анестезии роговицы (3 капли 1% раствора дикаина) и фиксации глазного яблока косо у лимба вкалывают иглу шприца, вводят ее в переднюю камеру (осторожно, не ранить радужную оболочку и капсулу хрусталика!) и отсасывают 0,3 мл содержимого передней камеры.
При эндофтальмите может возникнуть потребность в получении материала из стекловидного тела. Пункция глазного яблока проводится после анестезии (1 мл 2% раствора новокаина под конъюнктиву) острой и с достаточно широким просветом иглой, вкалываемой ближе к экватору. Отсасывается 0,3-0,5 мл внутриглазного содержимого.
Полученный материал подвергается изучению с целью выявления микроба и определения его вида (микробиологический диагноз). Материал может изучаться:
- на предметном стекле (бактериоскопический метод);
- в посевах (собственно бактериологический метод);
- в эксперименте на животном (биологический метод).
Бактериоскопический метод
может быть использован в условиях любого глазного стационара при наличии несложного лабораторного оборудования и некоторых реактивов.
Для этого необходимо иметь следующее:
- металлическую петлю;
- чистые предметные стекла (на чистом стекле капля воды расплывается, а не принимает шаровидную форму);
- ванночку с подставками для предметных стекол (стеклянные палочки или толстая медная проволока);
- дистиллированную воду;
- спирт;
- пинцет;
- фильтровальную бумагу;
- раствор Люголя (йода 1 г, йодистого калия 2 г, дистиллированной воды 300 мл);
- растворы красок (лучше в склянках, закрытых пипетками с резиновыми баллончиками).
Для очистки новые стекла кипятят в 1% растворе соды (можно использовать золу), а затем промывают водой, слабой соляной кислотой и вновь водой. Стекла, бывшие в употреблении, помещают на 1-2 часа в серную кислоту, после чего кипятят в растворе соды, промывают водой и опускают в 96° спирт. Хранят стекла либо в спирте, либо, вытерев спирт, сухими, в банках с притертой пробкой.
Наиболее употребительные краски: карболовый фуксин Циля (фуксина основного 1 г, кристаллической карболовой кислоты 5 г, спирта 96° 10 мл, глицерина — несколько капель, дистиллированной воды 100 мл). Для окраски фуксин Циля обычно разводят дистиллированной водой в 10 раз (разведенный, или водный фуксин). Метиленовая синька (метиленовой синьки 10 г, спирта 96° 100 мл). Из нее готовят щелочную синьку Леффлера (спиртового раствора синьки 30 мл, 1% калийной или натриевой щелочи 1 мл, дистиллированной воды 100 мл). Карболовый генцианвиолет (готовится так же, как карболовый фуксин Циля).
Микробов изучают либо в живом виде (способы «раздавленной» и «висячей» капли), либо убитыми (в окрашенном препарате). Исследование в живом виде в основном выявляет способность микробов к активному движению, тогда как окрашенные препараты позволяют хорошо изучить их морфологию.
Различают простые способы окраски, когда обычно употребляется одна краска, и сложные способы окраски, выявляющие некоторые особенности физико-химического строения микробной клетки и имеющие поэтому дифференциально-диагностическое значение.
Техника приготовления окрашенных препаратов сводится к следующему. Материал наносят на чистое предметное стекло и равномерно распределяют по поверхности в виде кружка или овала. Мазок должен быть достаточно тонким. При наличии густого гноя следует предварительно нанести на предметное стекло одну каплю дистиллированной воды и размешать материал в этой капле. Мазок высушивают на воздухе. Стекло с высушенным препаратом берут за края большим и указательным пальцами мазком кверху и фиксируют троекратным проведением через пламя спиртовой горелки (на границе светлой и темной его части). При достаточной фиксации ощущается легкое жжение в пальцах. Зафиксированный мазок окрашивают. Готовят несколько препаратов, по меньшей мере два, один из которых окрашивают простым способом (метиленовая синька Леффлера, разведенный фуксин Циля), другой — по способу Грама.
Окрашивание по Леффлеру:
- на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор синьки Леффлера на 3-5 минут;
- препарат промывают дистиллированной водой и высушивают.
Окрашивание по Граму:
- на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, на который наливают раствор генцианвиолета на 1-2 минуты;
- сливают краску, снимают бумажку и, не промывая водой, наливают яа препарат люголевский раствор на 1 минуту; при этом мазок чернеет;
- сливают люголевский раствор и обесцвечивают мазок спиртом (лучше путем погружения препарата в стаканчик со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек);
- тщательно промывают водой;
- заливают мазок разведенным фуксином на 1-2 минуты;
- сливают краску, промывают препарат водой и высушивают.
Удобный способ Грама в модификации Синева, который предложил пользоваться заранее приготовленными кусочками фильтровальной бумаги, пропитанной раствором генцианвиолета и высушенной. На мазок предварительно наносят 2-3 капли воды и затем кладут эти кусочки бумаги. Дальше поступают, как описано выше.
Микроскопию мазков производят с иммерсионным объективом. При окраске по Леффлеру все микробы окрашиваются в синий цвет; при окраске по Граму — либо в сине-фиолетовый (грамположительные микробы), либо в красный цвет (грамотрицательные микробы).
Ограниченное число микробов, участвующих в заболеваниях наружного отдела глаза, и их характерные морфологические признаки нередко позволяют поставить правильный микробиологический диагноз уже с помощью одного только бактериоскопического исследования.
Бактериологический метод
становится необходимым в тех случаях, когда изучение в мазках оказывается недостаточным для установления вида микроба или возникает потребность в определении чувствительности выделенного возбудителя к антибактериальным препаратам.
Отсылая за подробным ознакомлением с бактериологическим методом к специальным руководствам по микробиологии, остановимся здесь лишь на принципах этого метода. Первый этап работы сводится к выделению отдельных видов микробов, т. е. к получению чистых культур. Для этого прибегают к механическому разобщению материала при посеве и к использованию сред, наиболее пригодных для развития предполагаемых возбудителей (элективные среды). Путем пересева отдельных колоний, выросших на среде, получают чистую культуру, которую исследуют под микроскопом (готовят мазки) и пересевают на дифференциально-диагностические среды для изучения биохимических свойств возбудителя.
Высокая требовательность большинства патогенных для глаза микробов в условиях культивирования обусловила преимущественное применение для их выделения элективных сред, содержащих нативный белок. Таковы, например, среда Эльшнига (одна часть лошадиной сыворотки или асцитической жидкости и две части бульона), свернутая сыворотка Леффлера (три части сыворотки и одна часть бульона с 1% пептона, 0,5% NaCl и 1% виноградного сахара), кровяной агар Левенталя (агар и 5-10% дефибринированной крови).
Что касается определения чувствительности микробов к антибиотикам, то наиболее простой способ такого определения заключается в использовании специально изготовляемых промышленностью дисков из фильтровальной бумаги, пропитанных растворами антибиотиков и высушенных в вакууме. Материал для исследования (гной, пунктат, извлеченное инородное тело) помещают в стерильную пробирку с физиологическим раствором (1,5-2 мл). После встряхивания жидкость выливают в чашки Петри, лучше в две — одну с сахарным, другую с кровяным агаром — и покачиванием равномерно распределяют по поверхности среды. Затем на поверхность агара накладывают диски с различными антибиотиками на расстоянии 2 см друг от друга и от края чашек. Чашки ставят в термостат (37°) и на следующий день по величине зоны задержки роста вокруг дисков судят о степени чувствительности микроба к испытуемым антибиотикам. Отсутствие зоны задержки роста указывает на нечувствительность микроба к данному антибиотику.
Биологический метод
в глазной практике применяется только в тех случаях, когда при затрудненной диагностике токсигенное свойство может оказаться решающим в определении вида микроба (например, при дифференциальной диагностике дифтерийной палочки и палочки ксероза).
Лабораторная диагностика вирусных заболеваний глаза
В настоящее время специальное изучение вирусов, в том числе вируса трахомы (рис. 77), осуществляется с помощью культивирования их в культурах тканей (куриный эмбрион, асцит-карцинома мышей и др.) и электронной микроскопии.
Рис. 77. Клеточные включения при трахоме.
В клинической практике для диагностики трахомы применяется метод цитологического изучения соскоба конъюнктивы на наличие или отсутствие телец (включений) Провачека—Гальберштедтера. Для этого тупым скальпелем или краем предметного стекла соскабливают эпителиальный покров конъюнктивы (без крови), который наносят тонким слоем на предметное стекло, в течение 5 минут подсушивают на воздухе и фиксируют путем опускания на 15-20 минут в стаканчик с метиловым спиртом или смесью Никифорова (этиловый эфир и абсолютный спирт в равном количестве). Окраску производят в течение 3-4 часов свежеприготовленным раствором краски Романовского—Гимза (из расчета одна капля краски на 1 мл дистиллированной воды). Затем препарат промывают текучей водой, подсушивают на воздухе и исследуют под микроскопом. При этом ядра эпителиальных клеток оказываются окрашенными в розовый цвет, протоплазма — в светло-синий, включения — в синий, сине-фиолетовый цвет (рис. 77). Последние представляются в виде кокковидных образований, расположенных среди мелкозернистой массы, и признаются носителями трахоматозного вируса. Они чаще обнаруживаются в свежих случаях нелеченой трахомы, но могут встречаться и при паратрахомных конъюнктивитах.
Исследования последних лет выявили новую форму контагиозного вирусного заболевания глаз — эпидемический кератоконъюнктивит, а цитологическое изучение конъюнктивального соскоба при этом заболевании позволило обнаружить в эпителиальных клетках своеобразные включения, совершенно отличные от телец Прсвачека (Б. Л. Поляк, Н. В. Плошинская).
