Бактериоскопический метод исследования предусматривает изучение микроорганизмов в живом или фиксированном и окрашенном состоянии. Для изучения микроорганизмов в живом состоянии используют метод раздавленной капли и метод висячей капли.

Наиболее часто применяют микроскопию бактерий в фиксированном и окрашенном состоянии. Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.

Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.

Для окрашивания микробов простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, водным раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания предполагают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Окраска по Граму:

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 2-3 минуты бумагу снимают, а краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный цвет.

Структура бактериальной клетки

Структурные компоненты бактериальной клетки делят на 2 вида:

- основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид);

- временные структуры (капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий).

Основные структуры.

Клеточная стенка находится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Цитоплазматическая мембрана не входит в состав клеточной стенки. Функции клеточной стенки:

Защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;

Определение формы бактерий;

Участие в метаболизме бактерий.

Клеточная стенка пронизана порами, через которые происходит транспорт экзотоксинов бактерий. Толщина клеточной стенки составляет 10–100 нм. Основной компонент клеточной стенки бактерий - пептидогликан или муреин, состоящий из чередующихся остатков N-ацетил-N-глюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидными связями.

В 1884 году Х. Грам предложил метод окраски бактерий с помощью генцианвиолета, йода, этилового спирта и фуксина. Все бактерии в зависимости от окраски по Граму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм. В ней имеются тейхоевые кислоты (полимеры глицерина или рибита), а также в небольших количествах полисахариды, белки и липиды. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий многослойна, ее толщина составляет 14-17 нм. Внутренний слой (пептидогликан) образует тонкую непрерывную сетку. Внешний слой состоит из фосфолипидов, липопротеина и белков. Белки наружной мембраны прочно связаны с пептидогликановым слоем.

В некоторых условиях бактерии лишаются способности полностью или частично синтезировать компоненты клеточной стенки, в результате чего образуются протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Сферопласты – это бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой. Они наблюдаются у грамотрицательных бактерий. Протопласты - это формы, полностью лишенные клеточной стенки. Они образуются грамположительными бактериями. L-формы бактерий - это мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки (бактерии с дефектной клеточной стенкой). Свое название они получили от названия института Листера в Англии, где были открыты в 1935 году.

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные. Цитоплазматическая мембрана (плазмолемма) - это полупроницаемая липопротеидная структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки. Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков (50-75%) и липидов (15-20%). Основная масса липидов представлена фосфолипидами. Кроме того, в составе мембраны обнаружено небольшое ко­личество углеводов.

ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:

Барьерная функция (молекулярное “сито”);

Энергетическая;

Избирательный перенос раз­личных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;

Репликация и последующее разделение хро­мосомы.

В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом .

Цитоплазма - это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.

Цитозоль - гомогенная фракция, включающая растворимые компоненты РНК, ферменты, продукты метаболизма.

Структурные элементы - это рибосомы, внутрицитоплазматические мембраны, включения и нуклеоид.

Рибосомы - органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Они состоят из белка и РНК. Представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.

В цитоплазме прокариотов обнаруживаются различные включе­ния, представляющие запасные вещества клетки. Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество - гранулеза. Полифосфаты содержатся в гранулах, назы­ваемых волютиновыми , или метахроматиновыми , зернами.

Нуклеоид является ядром у прокариотов. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую рассматривают как бактериальную хромосому. У нуклеоида отсутствует ядерная оболочка.

Кроме нуклеоида в бактериальной клетке обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды , которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования. Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R-плазмиды), синтез энтеротоксинов (Ent-плазмиды) или гемолизинов (Hly-плазмиды).

К временным структурам относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.

Капсула - это слизистый слой над клеточной стенкой бактерии. Вещество капсул состоит из нитей полисахаридов. Капсула синтезируется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны и выделяется на поверхность клеточной стенки в специфических участках.

Функции капсулы:

Место локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий;

Защита клеток от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, действия защитных факторов макроорганизма;

Способность прикрепления клеток к субстрату.

Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. Количество жгутиков и места их расположения у разных бактерий неодинаково. В зависимости от этого выделяют следующие группы жгутиковых бактерий:

- монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;

- амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;

- лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;

- перитрихи – бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.

Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином .

К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также ворсинки и пили . Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (ворсинки, пили общего типа) и в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим гидрофобным белком пилином.

У некоторых бактерий в определенных условиях образуются покоящиеся формы, которые обеспечивают переживание клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях - эндоспо­ры . Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.

Расположение спор в клетке:

Центральное (возбудитель сибирской язвы);

Субтерминальное - ближе к концу (возбудитель ботулизма);

Терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).

Простой метод окраски. Является одноэтапным и заключается в окраске микропрепарата одним красителем. Используют основные анилиновые красители, такие как, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде водных растворов или пропитанных красителем фильтровальных бумажек, которые помещают на мазок и смачивают водой. Продолжительность окраски составляет 3-5 минут, после чего микропрепарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. В препаратах, окрашенных простым методом, можно получить представление о форме, расположении и размерах микробных клеток.

Сложные методы окраски. Сложные (дифференцирующие) методы окраски (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Эти методы позволяют дифференцировать бактерии в зависимости от строения их структур, чаще всего поверхностных. Например, метод окраски по Граму позволяет дифференцировать бактерии по строению их клеточной стенки: грамположительные (фиолетовые) с толстой и грамотрицательные (красные) бактерии с тонкой клеточной стенкой.

Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактериальной клетки: капсул, цитоплазматических включений, спор, жгутиков.

Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену

Метод Грама. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, что является важным таксономическим признаком. Результат окраски определяется особенностями строения клеточной стенки бактерий. При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствора Люголя образуется комплексное соединение генцианвиолета и йода с пептидогликаном, которое при дифференциации спиртом удерживается в клетках грамположительных бактерий, имеющий многослойный пептидогликан и вымывается из грамотрицательных бактерий, имеющих тонкий слой пептидогликана. При дополнительной окраске водным раствором фуксина грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.

Таблица 4. Метод Грама

Этапы окраски	Цвет бактерий
1. На фиксированный мазок поместить фильтровальную бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить водой, 2-3 минуты	Все бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет
2. Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить раствор Люголя на 1 минуту	Все бактерии остаются фиолетовыми
3. Для дифференцирования нанести на мазок этиловый спирт и обесцветить в течение 30-60 с, промыть водой	Грамположительные бактерии остаются фиолетовыми, грамотрицательные обесцвечиваются
4. Нанести фуксин Пффейфера (водный раствор фуксина) и докрасить 1-2 мин, промыть водой, высушить	Грамположительные остаются фиолетовыми, грамотрицательные окрашиваются в красный цвет

Метод Циля-Нильсена. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии.

Таблица 5. Метод Циля-Нильсена

Кислотоустойчивые бактерии имеют особое строение клеточной стенки, содержащей большое количество сложных липидов (миколовых кислот, восков, глико- и фосфолипидов), что делает эти бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивыми. Клеточная стенка этих бактерий плохо воспринимает анилиновые красители и обычные способы окраски. Высокая температура в процессе окраски методом Циля-Нильсена расплавляет липиды, фенол разрыхляет клеточную стенку и краситель проникает внутрь клетки. После остывания препарата липиды вновь затвердевают, прочно удерживая краситель, поэтому кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной кислотой и остаются красными. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и их докрашивают контрастным красителем – метиленовым синим. В основном, метод используется для окраски бактерий, относящихся к роду Mycobacterium (M.leprae, M.tuberculosis, M,bovis и др.)

III. План практической работы

1. Изучить механизм и этапы окраски по Граму, приготовить мазок из смеси бактерий и окрасить по Граму, заполнить таблицу в рабочей тетради.

2. Изучить механизм и этапы окраски по Цилю-Нильсену, приготовить мазок из сапрофитных микобактерий, окрасить по Цилю-Нильсену, заполнить таблицу в рабочей тетради.

3. Сравнить строение прокариотической и эукариотической клетки по ряду признаков, заполнить таблицу в рабочей тетради.

4. Изучить и перечислить в таблице основные таксономические категории на примере C.tetani и T.pallidum или других бактерий.

Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. При простом методе используют один краситель. Метиленовым синим и щелочным синим Леффлера окрашивают препарат в течение 3-5 мин, фуксином Пфейффера - 1-2 мин (см. рис. 4).

На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и

Сложные методы окраски

Окраска по Граму (универсальный метод) . Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.

В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы - грамположительные и грамотрицательные.

Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.

Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет.

• 1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.
• 2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем краситель сливают.
• 3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.
• 4. Промывают препарат водой.
• 5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Окраска по Цилю - Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий) . Этот метод применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки первый этап окрашивания проводят при подогревании.

• 1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.
• 2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.
• 3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные - в синий (см. рис. 4).

Окраска по Ожешко (выявление спор) . 1. На высушенный на воздухе мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.

2. Окрашивают по способу Циля - Нильсена. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка - в голубой цвет (см. рис. 4).

Окраска по Бурри - Гинсу (выявление капсулы) . Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.

• 1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.
• 2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.
• 3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и высушивают на воздухе.

Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата черный, клетки - красные, капсулы - неокрашенные (см. рис. 4).

При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спирто-водного или водного раствора краски на 1-2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин (1:10) или леффлеровская метиленовая синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно фуксином (1:10) красят 10-30 секунд, а метиленовой синькой – 2-10 минут. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно, а при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще, продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка.

Окраска по Муромцеву

Готовят два раствора:

После растворения краски оба раствора смешивают и профильтровывают через бумажный фильтр. Краска сохраняется долгое время. Мазки красят через полоски фильтровальной бумаги в течение 15 – 30 секунд.

При данной окраске мазков в микробных клетках выявляются включения, биполярность, капсулы и споры. Метод удобен для окраски мазков из органов, крови, культур на средах с нативным белком и на полужидком агаре.

Фон препарата из указанных субстратов розовый; клетки ткани и микробные тела окрашиваются в голубовато-синие цвета.

Сложные (дифференциальные) методы окраски мазков

Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является главной (основной) краской, а другое – дополнительной (контрастной). После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Промывание мазка простой водой также является чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполным. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото- и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивыми. Наконец, некоторые, например, споры, энергично противостоят воздействию всех обесцвечивающих веществ и относятся к группе краскоустойчивыx.

Сложные методы окраски имеют важное дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба.

Окраска по Граму

При обработке мазков (срезов) из органов и тканей, содержащих микроорганизмы, генцианвиолетом, а затем йодом, препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При этом одни из содержащихся в мазке бактерий также обесцвечиваются, а другие окра­шиваются в фиолетовый цвет. При дополнительной окраске (в частности, фуксином Пфейффера) обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), не обесцве­чивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий. Разница между грамположительными и грамотрицательными бактериями зависит от различия их изоэлектрических точек, а способность грамположительных бактерий удерживать окраску связана с присутствием в них магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, которой грамотрицательные бактерии не содержат. Лучше всего окраска по Граму получается после фиксации мазков физическим методом (нагреванием). Особенности отношения тех или иных видов бактерий к разным краскам, в частности, к окраске по методу Грама, характеризуют так называемые тинкториальные свойства микробов.

Техника окраски. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, или другой какой-либо фиолетовой трифенилметановой краски (напримep метилвиолета) на 1-2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1-2 минуты. Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30-60 секунд, промывают водой и окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафра­нином, нейтральротом или везувином) в течение 2-3 минут. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму грамположительные микробы будут окрашены в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в цвет дополнительной краски (например, в розовый цвет фуксина Пфейффера).

Нельзя пользоваться загрязненной фильтровальной бумагой: возможен механический перенос микробов с одного мазка на другой, что может отра­зиться на результатах микроскопии. Продолжительность воздействия краской, раствором Люголя (протравой) и спиртом зависит от толщины мазка. Особенно ответственным моментом в окраске по Граму является обесцвечивание мазка спиртом. При коротком воздействии спирта получаются перекрашенные препараты, а при длительном все микробы (в том числе и rpaмположительные) обесцветятся. На густой, толстый мазок (например, из агаровой культуры) время воздействия спиртом должно быть большим, нежели на тонкий мазок, особенно с жидких культур. При воздействии спиртом на неравномерно приготовленный мазок в толстых его частях микробы оста­лся необесцвеченными, а в тонких обесцветятся; получится «пестрая» картина окраски, что может привести к неправильным выводам.

Иногда в культуре грамположительных бактерий могут наблюдаться грамотрицательные особи, которых тем больше, чем старше популяция. Это ничто иное, как бактериальные трупы, претерпевшие внутриклеточный автолиз, в результате которого клетка лишилась рибонуклеинатов магния. С другой стороны, в очень молодых культурах (несколько часов роста) из семейства энтеробактерий гигантские, юные формы этих бактерий, которые в 2-3 раза крупнее взрослых особей (18-часовых), очень базофильны вследствие перегрузки их цитоплазмы рибонуклеинатами. Поэтому при окраске по Граму они окрашиваются фуксином так интенсивно, что при плохом освещении их можно принять за грамположительные вегетативные формы спороносных палочек.

Для начинающих, а также в сомнительных случаях, рекомендуется на том же стекле, где находится исследуемый мазок, приготовить по сторонам кон­трольные препараты - один из культуры микробов, заведомо грамположительных, а другой - из грамотрицательных.

При обесцвечивании препарата в окраске по Граму спирт можно нали­вать непосредственно на мазок, постоянно покачивая стекло. Лучше же обесцвечивание проводить в кюветках, куда наливают спирт и, захватив пинцетом Корнэ препарат, поднимают и опускают его, следя за цветом сте­кающего со стекла спирта. Обесцвечивание считается законченным, когда стекающие с мазка капли спирта сравняются по цвету со спиртом в кюветке; обычно для этого требуется 10-30 секунд, в зависимости от толщины мазка.

Спирт 96° в кюветках следует чаще сменять (80° спирт уже неправильно дифференцирует мазок). Отработанный спирт обычно сливают из кюветок в спиртовые горелки.

Для начинающих можно рекомендовать обесцвечивание мазков йодированным спиртом. Установлено, что если к обесцвечивающей жидкости добавить немного йодной настойки, то микробы, окрашивающиеся грамположительно, не обесцвечиваются в такой жидкости даже в течение часа, а грамотрицательные раскрашиваются приблизительно в 5 секунд. По дан­ным Саватеева, достаточно добавить 2-4 мл 10% йодной настойки на 100 мл 95° спирта; раствор может сохраняться долгое время. В том случае, если вместо спирта используют ацетон, йодную настойку прибавляют перед использованием.

Для обесцвечивания мазков йодированным спиртом достаточно двух минут, после чего следует промывка водой и дополнитель­ная окраска фуксином Пфейффера.

Мы живем в мире бактерий. Они вокруг нас и внутри нашего организма. Не удивительно, что мы хотим знать о них как можно больше. Но как рассмотреть и тем более изучить что-то настолько маленькое? Микроскоп, казалось бы, должен решить эту проблему. Но не все так просто – в своем естественном состоянии микроорганизмы прозрачны как стекло. «Проявить» картинку помогают различные методы окраски бактерий, помогающие исследовать внешнее и внутреннее строение микробов.

В конце девятнадцатого века датский биолог Кристиан Грам предложил решение этой проблемы. Если что-то невидимо, его нужно покрасить и посмотреть, что получится. Метод окраски бактерий, предложенный Грамом, был настолько убедителен, что и по сей день микроорганизмы разделяют на грамположительные (удерживающие окраску) и грамотрицательные (обесцвечивающиеся после обработки спиртом).

Как оказалось, клетки покрыты оболочкой, похожей на переплетенные между собой нити. И хотя в просветы между нитями свободно проходят питательные вещества, необходимые клетке, оболочка надежно защищает «внутренний мир» от внешних агрессивных факторов. У разных видов бактерий наружная стенка клетки имеет различную толщину, плотность и химический состав. Именно на этом свойстве клеточных оболочек базируется метод окраски по Граму.

Отталкиваясь от работ Кристиана Грама, биологи разработали новые методы, позволяющие не только определить форму и размер клеток, но и рассмотреть некоторые подробности их строения. Иногда микроорганизмы, совершенно идентичные по внешнему виду, по-разному реагируют на красители. Полученная информация дает возможность быстро и точно определить вид бактерий.

Старый – не значит плохой

Пожалуй, самый практичный и широко применяемый способ окрашивания микроорганизмов – метод Грама. Мазок, зафиксированный огнем, покрывают метиловым фиолетовым красителем, фиксируют йодом, просушивают и промывают спиртом. На этом этапе, в зависимости от свойств клеточной мембраны, бактерии становятся:

• ярко-синими (грамположительные);
• бесцветными (грамотрицательные).

Толщина оболочки клеток, оставшихся бесцветными, не позволяет краске проникнуть внутрь, и она легко смывается с поверхности бактерий. Последним шагом окрашивания по Граму является использование красного красителя, он остается на поверхности клеточной мембраны и придает ей розовый или красный оттенок.

Грамположительные бактерии, как правило, опасны для человека. К этой категории относятся стрептококки, стафилококки, бациллы, клостридии и т. д. Грамотрицательные не настолько опасны. Они тоже могут вызывать болезни и воспаления, но только при определенных условиях. Таким образом, просто приготовив окрашенный препарат, можно получить представление о степени опасности исследуемых микроорганизмов.

Витальные методы окраски

По состоянию исследуемых организмов в микробиологии существуют:

• витальный способ, т. е. работа с живыми бактериями (опасен, требует строгого соблюдения техники безопасности);
• поствитальный метод – работа с фиксированными (убитыми) клетками;
• негативный, может быть витальным и поствитальным, удобен для работы с капсулами.

Витальный метод, безусловно, самый опасный, так как исследователям приходится иметь дело с живыми клетками, иногда представляющими смертельную опасность. Однако именно такой способ дает возможность изучать не только строение клетки, но и весь ее жизненный цикл и взаимодействие с окружением.

Для многих микробиологических исследований важно сохранить бактерии живыми. Это значит, что нужно использовать специальные нетоксичные или низкотоксичные красители, к тому же легко проникающие в структуру клетки через наружную оболочку. Это так называемые витальные красители, они могут быть предназначены для видимого света или флуоресцентными. По химическому составу красители разделяются на:

• основные (акридиновый оранжевый, метиленовый синий);
• кислотные или кислые (индигокармин, кислый фуксин);
• нейтральные (родамин В).

Работа с фиксированными препаратами

По сложности работы методы окраски фиксированных (неживых) клеток разделяются на:

1. Простые методы. В этом случае используют только одну краску, как правило, красную (фуксин) или синюю (метиленовый синий). Разница между этими красителями состоит в скорости воздействия. Фуксин дает результат уже через 1-2 мин., тогда как результат работы синей краски нужно ждать 3-5 мин. Использовать раствор фуксина в карболовой кислоте (т. н. фуксин Циля) удобно еще и потому, что приготовленный препарат в течение нескольких месяцев не теряет окрашивающих свойств. Метиленовый синий краситель тоже может быть подготовлен заранее в крепком спиртовом растворе.
2. Сложные (дифференциальные) методы. Здесь потребуется несколько красителей (минимум два), имеющих различный цвет. Это позволит не просто увидеть бактерии, но и подробнее изучить их внутреннее строение, так как различные участки клетки могут по-разному воспринимать красители. К сложным относят методы Грама, Циля – Нильсена (для кислотоустойчивых бактерий), Бениньетти (окраска бактериальных жгутиков), Гинса (выявление капсул), дифференцирующий метод Романовского – Гимзы (окраска спор) и некоторые другие.

Особенно важны сложные методы для диагностики инфекционных заболеваний, например, способ окраски Нейссера помогает отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийных.

Дифференцирующий способ Романовского – Гимзы основан на применении специального готового порошка, на основе которого лаборатории готовят раствор красителя нужной концентрации. Преимущество этого способа в том, что цитоплазма и ядро клетки получают различную окраску, что облегчает идентификацию и изучение микроорганизмов.

Метод Нейссера используют в медицине для обнаружения зерен волютина (гранул с запасом пищи для многих прокариотических клеток) у возбудителей дифтерии. В результате окрашивания бактерия приобретает желтый цвет, а гранулы волютина – синий.

Белым по черному

Еще одна разновидность окраски бактерий основана на свойствах негатива, т. е. на темном фоне препарата четко видны бесцветные бактерии, иными словами, окрашивается среда, а не сам организм.

Иногда бактерии, попадая в определенные условия, образуют капсулы. Это слизистые образования, покрывающие клетку, чем-то похожие на гель. Капсулы прозрачны, их химический состав может сильно отличаться у разных видов бактерий, т.е. просто покрасить и оценить результат по получившемуся цвету не выйдет.

Кроме того, капсулы мягкие и непрочные, при окраске они могут потерять форму. Красящие вещества плохо взаимодействуют с желеобразной структурой капсул и легко вымываются при обработке. Чтобы обнаружить, но не повредить капсулы, пригодится негативный способ окрашивания.

Одним из способов выявления капсул является метод окрашивания по Гинсу. Каплю черной туши наносят на край предметного стекла, вносят в нее исследуемый материал, перемешивают и распределяют по всей поверхности. Мазок сушат на воздухе, фиксируют и окрашивают фуксином Циля. Через 2-3 минуты промывают водой и высушивают. В результате под микроскопом на общем темном фоне отчетливо просматриваются розовые клетки, окруженные прозрачными капсулами.

Окраска спорообразующих бактерий

Если говорить о клеточных оболочках, то нельзя не вспомнить о спорообразующих бактериях. Споры образуются при неблагоприятных для клетки условиях и могут существовать в агрессивной среде довольно длительное время. То, что хорошо для сохранения клетки, плохо для ее изучения. Споры очень плотные и почти не пропускают жидкости, кроме того, они кислотоустойчивы. Следовательно, простое окрашивание или метод Грама оставят споры бесцветными.

Перед началом окрашивания приходится химически обрабатывать поверхность спор, чтобы она немного изменила свою структуру и позволила красящим веществам проникнуть внутрь. При этом окрашивается и вся цитоплазма клетки. Чтобы обесцветить цитоплазму, препарат промывают и высушивают. Краска в спорах, благодаря их более плотной структуре задерживается лучше, чем в цитоплазме.

Способы окраски спор могут быть разными, например, Ожешко или Циля – Нильсена, но все они сводятся к одной схеме:

• разрыхление поверхности спор химическими веществами (кислоты, аммиак, едкий натр);
• окрашивание клетки со спорой (обычно при нагревании);
• обесцвечивание цитоплазмы.

В результате получаем отлично видимую ярко окрашенную спору и бледную, почти прозрачную цитоплазму.

Как рассмотреть бактериальные жгутики

Еще одна непростая задача – окраска бактерий со жгутиками. Это спирально закрученные очень тонкие нити, которые микроорганизмы используют для перемещения. Жгутики необычайно тонкие, при окрашивании они легко отрываются от клетки. Поэтому перед началом окрашивания жгутики протравливают, искусственно увеличивая в объеме.

При подготовке микроорганизмов к исследованию бактериальную культуру несколько раз пересеивают на свежую питательную среду в течение нескольких дней. Затем бактерии со жгутиками переносят в пробирку со стерильной водой (t 37⁰С). Делают это предельно осторожно, не перемешивая жидкость, чтобы не повредить жгутики.

Содержимое пробирки оставляют примерно на час, чтобы бактерии равномерно распределились по всему объему. Перед началом исследования проверяют подвижность клеток в висячей капле. Если движения нет, пробирку оставляют еще на некоторое время.

При нанесении раствора на предметное стекло клетки могут легко потерять жгутики. Поэтому поверхность стекла должна быть идеально чистой и обезжиренной. Перед нанесением капель раствора предметное стекло проводят над горячей частью пламени горелки, чтобы попавшие на поверхность капли расплылись и быстро высохли.

После высыхания мазок протравливают, через 15 минут химикат смывают. Следующий этап – окраску фуксином – проводят, погружая стекло в раствор красителя, чтобы не повредить жгутики при нанесении краски.

Выдержав нужное время, мазок промывают водой и высушивают. Теперь можно переходить к исследованию получившегося результата.

Техника окрашивания

Для получения окрашенного препарата нельзя просто взять кисточку, краски и отловить бактерию. Существует определенная схема работы с микроорганизмами:

1. Приготовление мазка. На предметное стекло (стерильное) наносят каплю воды, в которую затем бактериологической петлей вносят и распределяют по поверхности лабораторный материал.
2. Высушивание. Лишняя жидкость высушивается либо естественным путем при комнатной температуре, либо мазок немного прогревается высоко над пламенем горелки.
3. Фиксация. Мало просто убрать воду, нужно закрепить бактерии на предметном стекле. Для этого можно использовать огонь (несколько проходов над самой горячей частью пламени) или жидкость (спирт, ацетон). После такой обработки микроорганизмы быстрее впитывают краску.
4. Непосредственно окрашивание. Краска должна полностью покрывать всю поверхность мазка. Выдержав нужное время (для каждого красителя свое), краску убирают и промывают препарат водой.

После высыхания (обычно естественным путем) полученный результат можно использовать по назначению.

Окрашивание микроорганизмов – это целая система методов, приемов, схем, направленных на обнаружение и распознавание клеток при помощи микроскопа. Ни одно медицинское исследование или научная работа в микробиологии не обходятся без предварительной подготовки и окраски изучаемого материала.