Высших организмов, открыты онкогены и т.п. (см. Мигрирующие генетические элементы).
IS-ЭЛЕМЕНТЫ И ТРАНСПОЗОНЫ БАКТЕРИЙ
Транспозоны вместе с плазмидами и фагами (в к-рые они легко интегрируются) способны осуществлять обмен разл, заключенных в них генов между весьма отдаленными видами бактерий , поэтому они играют чрезвычайно важную роль в эволюции бактерий , включая адаптацию их к лек. в-вам и продуцирования ими новых токсинов.
Транспозоны и 15-элементы ответственны за целый ряд генетических явлений у бактерий. Встраивание мобильного элемента в какой-либо ген может привести к его инактивации. Кроме того, некоторые IS-элементы и транспозоны вызывают генетическую нестабильность поблизости от места своей локализации в окрестностях элемента заметно повышается частота делеций и инверсий, причем одна из границ перестройки всегда совпадает с одним из концов 15-элемента , автономного или в составе транспозона. Мобильные элементы способны вызывать также транслокации. Действительно, два расположенных на некотором расстоянии друг от друга IS-эле-мента можно рассматривать как транспозон и такие транспозоны действительно способны к перемещению как одно целое, хотя по крайней мере для некоторых IS-элементов показано, что частота перемещения такой составной структуры быстро падает с увеличением расстояния между фланкирующими IS-элементами.
Подобные парадоксы. можно разрешить, вспо.мнив, что и плазмиды и мобильные генетические элементы обладают сравнительной автономией от основной массы генетического материала , и поэто .му их можно рассматривать как своего рода организмы, обитающие в особой, генетической, среде. Таким образом, можно рассматривать функции плазмид , IS-элементов и транспозонов не с точки зрения преимуществ, которые они несут бактериям-хозяевам, а с точки зрения их самоподдержания в бактериальных популяциях, другими словами, можно считать автономные элементы прокариот эгоистической ДНК, обеспечивающей в первую очередь собственное размножение. В этом смысле. мобильные элементы и плазмиды непосредственно примыкают к вирусам, эгоистические тенденции которых очевидны.
Какие же гены оказываются полезными и входят в состав мобильных элементов Это не праздный вопрос, поскольку каждая бактериальная клетка хорошо приспособлена к своей среде обитания и не нуждается в генах, аналогичных тем, которые у нее уже есть и обеспечивают ее адаптацию к среде. С другой стороны, приспособление к совершенно новой среде обитания , по-видимому, требует относительно значительной перестройки генетического материала клетки, включающей, в частности, коадаптацию многих разных генов. Поэтому клетка может получить селективное преимущество за счет приобретения какого-либо гена (в составе транспозона) лишь в том случае, если этот ген сам по себе способен оказаться выгодным для бактерии в определенных условиях, т. е. именно такие гены выгодно иметь транспозонам в своем составе. Действительно, на транспозонах путешествуют гены устойчивости к различным бактериальным ядам, в том числе к тяжелым металлам и антибиотикам, гены дополнительных метаболических путей , позволяющие использовать, например, какой-нибудь необычный , наконец гены некоторых токсинов, делающие бактерии патогенными и позволяющие им тем самым существенно изменить образ жизни.
| Рис. 15.13. Выявление транспозонов путем электронно-микроскопического исследования гетеродуплексов . Для того чтобы сделать транспозон видимым, нагревают ДНК из бактерии дикого типа (В) и бактерия, несущей транспозон (А), и в результате цепи двойных спиралей расходятся (плавление). При последующем медленном охлаждении смеси происходит спаривание комплементарных оснований отдельных цепей ДНК А и В, что ведет к образованию гетеродуплексов ДНК. Если на концах транспозона имеются противоположно ориентированные комплементарные IS-элементы, то эти области тоже спариваются и образуют стебелек , на котором средняя часть транспозона выступает вбок в виде петли из одиночной цепи. |
Транспозоны бактерий обладают сходной структурной организацией (рис. 2.1). Все они ограничены концевыми инвертированными повторами, протяженность и состав которых различны у разных транспозонов (от десятка до нескольких сотен п.н.). Однако у определенного транспозона они представляют собой своеобразные константы, т. е. не изменяются при его внедрении в разные сайты. Характерной чертой транспозонов бактерий является и тот факт, что с обоих концов они ограничены прямыми повторами реципиентной ДНК (ДНК-мишени). Протяженность этих повторов варьирует от 5 до 9 п.н., но для конкретного элемента она постоянна . Последовательность же нуклеотидов в повторах определяется местом локализации элемента . В сайтах независимого происхождения транспозон фланкирован повторами различного состава.
Мутации, вызываемые транспозонами. В генетике бактерий все большее значение приобретает метод получения мутаций с помопдью транс-позонов. Транспозоны (Тп) представляют собой короткие двойные цепи ДНК, которые состоят из более чем 2000 пар оснований и обычно обусловливают устойчивость к одному антибиотику, в исключительных случаях-к нескольким, Транспозоны способны перепрыгивать из одного участка генома в другой, в частности из бактериальной хромосомы в плазмиду и обратно таким образом, они могут включаться в различные участки генома (см. разд. 15.3,1), В случае внедрения транспозо-на в какой-либо структурный ген хромосомы нуклеотидная последовательность этого гена будет нарушена и генетическая информация не сможет транслироваться в функционально полноценный полипептид. ВЬзникнет инсерционный мутант.
Выше упоминалось, что мобильные элементы вызывают генетическую нестабильность поблизости от участка своей локализации. Эта особенность легко объясняется уже известными нам свойствами IS-элементов и транспозонов бактерий, На рис. 80 показано, что получится при перемещении в пределах одного репликона транспозона типа ТпЗ, т.е. с репликативным механизмом транспозиции . В зависимости от того, как внесены разрывы в ДНК-мишень, получится либо делеция , либо инверсия генетического материала между местом расположения транспозона и мишенью его перемещения. По-сути дела, образование делеции напоминает процесс распада коинтеграта , но поскольку одна из образовавшихся молекул ДНК не имеет ориджина репликации , она утрачивается. Если происходит инверсия, то на обеих ее границах оказывается по копии транспозона в инвертированной друг относительно друга ориентации. Таким образом, образование делеций и инверсий характерно для репликативг ного механизма транспозиций.
Ключевым свойством бактериальных мобильных элементов , обеспечивающим их сохранение, является их способность перемещаться с репликона на репликон . Наличие у бактерий трансмиссивных и мобилизуемых плазмид позволяет транспозонам и IS-элементам не только переходить с плазмиды на плазмиду или из хромосомы на плазмиду, но и путешествовать из клетки в клетку в составе плазмид . Таким путем мобильные элементы могут распространяться в бактериальных популяциях, даже если не приносят своим хозяевам никаких преимуществ. В этой связи следует упомянуть о явлении иммунности к транспозиции многие транспозоны и IS-элементы значительно чаще перемещаются на новые репликоны, чем на новое место в составе того репликона, в котором они находятся. Молекулярный механизм этого свойства еще не выяснен, но очевидно, что оно способствует распространению мобильного элемента по максимальному количеству репликонов.
Одинаковые IS-элементы и транспозоны, расположенные на разных репликонах, способны обеспечивать гомологичную рекомбинацию , приводящую к образованию коинтеграта . Именно таким путем некоторые плазмиды обратимо встраиваются в хромосому бактерий, что сразу обеспечивает добавление значительного фрагмента генетического материала (рис. 82). Плазмиды, способные встраиваться в хромосому бактерий и вырезаться оттуда, называют эписомами. Иногда вырезание эписомы может происходить не по той паре IS-элементов , по которой прошла интеграция . В этом случае плазмида может захватить часть хромосомного материала, а часть своей ДНК
Плазмиду, несущую модифицированный транспозон Тп5 со встроенным геном токсина, ввели в бактерию, в хромосомную ДНК которой был встроен транспозон Тп5 дикого типа.
У многих бактерий обнаружены нехромосомные генетические элементы плазмиды, умеренные фаги и мигрирующие элементы (транспозоны и 15-элементы). Для плазмид характерно стабильное существование в нехромосомном состоянии. Транспозоны и 15-элементы входят, как правило, в состав хромосом, но способны переходить из хромосомы в плазмиду, поэтому также могут быть отнесены к нехромосомным генетическим элементам.
Транспозоны могут служить маркером гена, предназначенного для клонирования. Как известно, при клонировании хромосомных генов бактерий иногда возникают сложности, связанные с тем, что нет простого метода , позволяющего выявить, какая из плазмид , несущих встроенный фрагмент хромосомной ДНК, содержит интересующий исследователя ген. Иногда эту проблему удается решить, выделив сначала мутант по этому гену с включенным в него или расположенным поблизости транспозоном.
В хромосомных ДНК прокариотических и эзгкариотических клеток имеются также контролирующие или так называемые "прыгающие" подвижные гены - транспозоны (Тп), впервые открытые Б Мак-Клинток в 1940 г у кукурузы Они находятся на значительном расстоянии от других генов, на которые оказывают влияние Благодаря мутациям, названным "транспозонными взрывами", возможно массовое и в известной мере направленное перемещение генетических элементов Транспозоны способны реплицироваться и внедряться (инсерция) в виде одной из копий в новое место генома (ДНК ядра) У бактерий преобладающая часть транспозонов кодирует фермент
Оглавление темы "Генетические элементы бактерий. Мутации у бактерий. Трансдукция.":2. Мутация. Мутации у бактерий. Мутагены. Спонтанные мутации. Обратные мутации (реверсии).
3. Индуцированные мутации бактерий. Химический мутагенез. Радиационный мутагенез. Типы мутаций.
4. Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия.
5. Перенос бактериальной ДНК. Конъюгация бактерий. F-фактор бактерии.
6. Трансформация бактерий. Стадии трансформации бактерии. Картирование хромосом бакетерий.
7. Трансдукция. Неспецифическая трансдукция. Специфическая трансдукция. Абортивная трансдукция. Феномен лизогении.
8. Свойства бактерий. Ненаследуемые изменения свойств бактерий. S - колонии. R - колонии. M - колонии. D - колонии бактерий.
Мигрирующие генетические элементы - отдельные участки ДНК, способные осуществлять собственный перенос (транспозицию) внутри генома. Транспозиция связана со способностью мигрирующих элементов кодировать специфический фермент рекомбинации - транспозазу.
Вставочные (инсерционные) последовательности [IS-элементы (англ. insertion, вставка, + sequence, последовательность)] - простейший тип мигрирующих элементов (рис. 4-15, А); их величина не превышает 1500 пар оснований (в среднем 800-1400). IS-элементы самостоятельно не реплицируются и не кодируют распознаваемых фенотипических признаков. Содержащиеся в них гены обеспечивают только их перемещение из одного участка в другой.
Основные функции IS-последовательностей - регуляция активности генов бактериальной клетки (могут инактивировать гены, в которые включились, или, встраиваясь в хромосому, проявлять эффект промотора, включающего либо выключающего транскрипцию соответствующих генов), индукция мутаций типа делеций или инверсий (при перемещении) и дупликаций (при встраивании в хромосому), координация взаимодействий плазмид, траспозонов и профа-гов (как между собой, так и бактериальной хромосомой).
Рис. 4-15. Инсерционная последовательность (А), транспозон (Б) .Транспозоны (Tn-элементы) состоят из 2000-25 000 пар нуклеотидов, содержат фрагмент ДНК, несущий специфические гены, и два концевых IS-элемента (рис. 4-15, Б). При включении в ДНК бактерий транспозоны вызывают дупликации, при выходе из определённого участка ДНК- делеций, при выходе и включении обратно с поворотом фрагмента на 180 градусов- инверсии. Транспозоны не способны к самостоятельной репликации и размножаются только в составе бактериальной хромосомы.
Каждый транспозон обычно содержит гены, привносящие важные для бактерии характеристики типа множественной устойчивости к антибактериальным агентам. Поскольку транспозоны содержат гены, определяющие фенотипически выраженные признаки (например, устойчивость к антибиотикам), то их легче обнаружить, чем IS-элементы. В общем, для транспозонов характерны те же гены, что и для плазмид (гены устойчивости к антибиотикам, токсинообразования, дополнительных ферментов метаболизма).
Умеренные и дефектные бактериофаги также могут быть факторами изменчивости, напоминая по своим свойствам интегрированные плазмиды. Встраиваясь в бактериальную хромосому в форме профага (провируса), они вызывают лизогенизацию бактерий, которые могут приобретать новые свойства.
Бактериофаги, как мигрирующие генетические элементы . В некоторых ситуациях факторами изменчивости могут быть умеренные, или дефектные, фаги, поскольку они могут встраиваться в хромосому (состояние профага) и выходить из неё, захватывая иногда и гены хромосомы клетки-хозяина (см. раздел «Трансдукция»). Например, u-бактериофаг сходен с IS-элементами и транспозонами, так как способен включаться практически в любой участок бактериальной хромосомы, привнося свой генетический материал и вызывая мутагенный эффект. Сохраняя все типичные свойства фага, р-бактериофаг можно рассматривать как гигантский транспозон.
В качестве мутагенных факторов биологической природы рассматривают мобильные (= мигрирующие ) генетические элементы бактерий – дискретные сегменты ДНК, способные к самостоятельному перемещению из одного участка в другой в пределах репликона, а также к перемещению из одного репликона (хромосомного, плазмидного или фагового) в другой. К таким элементам относятся: простые вставочные последовательности (IS-элементы), транспозоны (Tn-элементы) и фагитранспозоны (Mu, Д3112 и др.). Интеграция их в репликоны происходит независимо от системы общей рекомбинации клеток, которая требует обязательной гомологии у рекомбинирующих структур.
IS-элементы представляют собой линейные фрагменты двухцепочечной ДНК длиной от 200 до 2000 п. н. Они содержат только гены tnp , кодирующие синтез фермента транспозазы, необходимого для их миграции (транспозиции). По концам IS-элементов расположены инвертированные терминальные повторы (ITR). У разных IS-элементов длина концевых повторов ITR варьирует от 8 до 40 п. н. Инвертированные повторы также принимают участие и важны для транспозиции. Схематично строение IS- элемента можно изобразить следующим образом:
Различают несколько типов IS-элементов: IS1, IS2, IS3, IS4 и др. Они отличаются друг от друга по длине и структурой концевых повторов.
IS-элементы являются нормальными компонентами бактериальных хромосом и плазмид. В разных репликонах может содержаться различное, и часто множественное, число копий IS-элементов. IS-элементы могут перемещаться из одного участка генома в другой, например, из бактериальной хромосомы в плазмиду или от плазмиды к плазмиде. Также они могут встраиваться в пределах одного гена и инактивировать его или изменять его регуляцию.
Транспозоны – сложные мигрирующие элементы. Обозначаются как Tn 1, Tn 2,… Tn100, Tn 1002 и т.д. От IS-элементов они отличаются тем, что кроме генов, ответственных за транспозицию, содержат структурные гены, которые отвечают за проявление какого-либо фенотипа. Транспозоны могут контролировать резистентность к антибиотикам и ионам тяжелых металлов, способность к катаболизму лактозы, раффинозы, деградации толуола, синтезу энтеротоксинов и т. п., поэтому их легче обнаружить, чем IS-элементы. Длина транспозонов свыше 2000 п. н. Как и IS-элементы, транспозоны имеют инвентированные концевые повторы (ITR), которыми часто служат IS-элементы. Транспозоны различают не только по строению и составу, но и по степени специфичности при выборе мест интегрирования в репликоны. Однако следует отметить, что специфичность транспозиции одного и того же транспозона для разных видов бактерий и репликонов может быть различной.
Частота миграции транспозонов и IS-элементов происходит с вероятностью 10 –4 –10 –7 на одно деление бактериальной клетки. Она может зависеть от характера донорного и реципиентного репликонов, а также от генома клетки-хозяина. Кроме того, на перемещение транспозонов могут влиять факторы внешней среды (температура, УФ-лучи, химические соединения и др.). Механизмы перемещения транспозонов окончательно не изучены.
Бактериофаг Mu относится к умеренным бактериофагам. Характерной его особенностью является мутагенность, что отражено в названии Mu (mu tator ). Этот бактериофаг был впервые обнаружен у бактерий E. coli , но он размножается также на клетках Shigella , Klebsiella , Pseudomonas , Citrobacter , Salmonella и др. Он причисляется к мобильным генетическим элементам, так как во многих отношениях сходен с IS-элементами и транспозонами и отличается, по существу, только тем, что может формировать вирусные частицы. Сходство с IS-элементами и транспозонами в первую очередь выражается в том, что геном фага Mu (линейная двуспиральная ДНК – 38 т. п. н.) также имеет на концах инвертированные повторы, но только всего из двух нуклеотидных пар.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_1.jpg" alt=">МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ. ТРАНСПОЗИЦИИ">
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_2.jpg" alt=">В геномах плазмид, бактерий и эукариот широко распространены особые генетические элементы, способные перемещаться из"> В геномах плазмид, бактерий и эукариот широко распространены особые генетические элементы, способные перемещаться из одного участка генома в другой, - мобильные элементы. Разнообразные рекомбинационные процессы, лежащие в основе перемещений мобильных элементов, объединены под общим названием «транспозиции». Транспозиции осуществляются особыми белками, гены которых, в основном, локализованы в самих мобильных элементах. Гомология между мобильным элементом и последовательностью ДНК, в которую он перемещается (ДНК-мишень), как правило, отсутствует. Встраивание элементов, как правило, происходит в случайные сайты ДНК-мишени. Для мобильных элементов характерно пребывание в составе хромосом или плазмид.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_3.jpg" alt=">В большинстве своем мобильные элементы прокариот и эукариот построены по сходному плану. Сами элементы"> В большинстве своем мобильные элементы прокариот и эукариот построены по сходному плану. Сами элементы состоят из центральной части, фланкированной инвертированными повторами (ИП). Центральная часть обычно содержит ген (или гены), кодирующие белки транспозиции. Главный белок транспозиции – транспозаза. У ретроэлементов с длинными концевыми повторами энзим, соответствующий транспозазе, называют интегразой. Группа мобильных элементов бактерий содержит в центральной части также гены, не имеющие отношения к транспозиции, чаще всего это факторы устойчивости к антибиотикам, лекарственным веществам или ядам. Такие элементы при их открытии получили название транспозонов (Tn). Позднее так стали называть все мобильные элементы. Далее мы тоже будем называть все мобильные элементы транспозонами. Некоторые бактериальные транспозоны имеют на концах длинные ИП, в свою очередь являющиеся мобильными IS-элементами. В этих случаях центральная часть транспозона содержит только посторонние гены, а гены транспозиции находятся в IS-элементах, причем один из них, инактивирован одной или более мутациями.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_4.jpg" alt=">Основные типы мобильных элементов">
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_5.jpg" alt=">ИП абсолютно необходимы для транспозиции, поскольку именно их концы связываются транспозазой, и по ним"> ИП абсолютно необходимы для транспозиции, поскольку именно их концы связываются транспозазой, и по ним происходит рекомбинация. Отдельная группа ретротранспозонов не содержит никаких концевых повторов. Все мобильные элементы, кроме последней группы, на обоих концах фланкированы дуплицированными прямыми повторами (ДПП) из нескольких нуклеотидов ДНК-мишени. Состав этих нуклеотидов варьирует, так как мобильные элементы внедряются в случайные сайты ДНК-мишени, но их число постоянно для каждого элемента. Чаще всего оно равно 5. Таковы общие представления о структуре мобильных элементов. Далее отдельно рассмотрим мобильные элементы прокариот и эукариот.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_6.jpg" alt=">Структура мобильных элементов определяет механизмы их перемещений. Хотя эти механизмы различаются в деталях, имеется"> Структура мобильных элементов определяет механизмы их перемещений. Хотя эти механизмы различаются в деталях, имеется общий принцип реакций транспозиции. Процесс происходит в 3 этапа. На первом этапе 2 молекулы транспозазы соединяются с концами подвижного элемента, сводят концы вместе и генерирует в них разрывы, чаще всего в обеих цепях. Затем транспозаза делает в обеих цепях ДНК-мишени ступенчатые разрывы, отстоящие друг от друга на столько пар нуклеотидов, сколько обнаруживается в ДПП данного элемента. Второй этап – обмен цепями, приводящий к рекомбинации между ДНК оставляя, за счет ступенчатости разрывов, бреши между 5"-P-концами элемента и 3"-OH-концами мишени. Катализируемое транспозазой расщепление и замыкание концов цепей ДНК происходит без потери энергии связей и не требует АТФ, что напоминает консервативную сайт-специфическую рекомбинацию. Отличие от последней заключается в том, что транспозаза не образует ковалентной связи с 5’-P концом ДНК. На третьем этапе происходит репаративный синтез брешей, формирующий ДПП, а иногда еще и репликация элемента. Таков общий общий механизм транспозиционной рекомбинации. Различные конкретные механизмы транспозиций рассмотрим одновременно с описанием различных классов мобильных элементов.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_7.jpg" alt=">репликативная транспозиция нерепликативная транспозиция Схема, демонстрирующая общий принцип реакций транспозиции">
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_8.jpg" alt=">МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ ПРОКАРИОТ: IS-элементы, транспозоны Для бактерий и плазмид характерны мобильные элементы"> МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ ПРОКАРИОТ: IS-элементы, транспозоны Для бактерий и плазмид характерны мобильные элементы с короткими или длинными ИП. Длина ДПП, как правило, 5 или 9 п.н. Бактериальные мобильные элементы можно разделить на две основные группы: 1. IS-элементы: небольшие (размером не более 2,5 т.п.н.) элементы, которые состоят из центральной части с геном транспозазы, фланкированной двумя инвертированными повторами. 2. Собственно транспозоны, которые несут, кроме транспозазы, другие гены, не имеющие отношения к транспозиции (чаще всего гены устойчивости к антибиотикам). Собственно транспозоны можно в свою очередь разделить на следующие группы 1) Сложные транспозоны (семейство Tn3) – короткие ИП на концах, делают в ДНК-мишени ДПП из 5 п.н. и перемещаются по механизму репликативной транспозиции. 2) Составные транспозоны (Tn5, Tn9, Tn10) с длинными ИП, представляющими собой различные IS-элементы. Длина ДПП обычно 9 п.н. Примеры прокариотических мобильных элементов приведены в следующей ниже таблице.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_9.jpg" alt=">Структура мобильных элементов прокариот Общая схема структуры мобильных элементов прокариот">
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_10.jpg" alt=">Теперь рассмотрим детали. Основные механизмы транспозиций изображены на рисунках, следующих ниже. Репликативная транспозиция"> Теперь рассмотрим детали. Основные механизмы транспозиций изображены на рисунках, следующих ниже. Репликативная транспозиция отличается тем, что мобильный элемент, перемещаясь в другую молекулу, оставляет свою копию в исходной ДНК. Это может произойти только за счет удвоения (репликации) элемента. При репликативной транспозиции на концах подвижного элемента происходят разрывы с образованием выступающих 3’-OH-концов. Одновременно транспозаза делает разрывы в ДНК-мишени. 3’-OH-концы подвижного элемента ковалентно связываются с 5’-Р-концами мишени, и образуется структура с двумя вилками репликации на концах подвижного элемента. В вилках репликации инициируется синтез ДНК (направленный «внутрь»). В результате образуется две копии мобильного элемента. При этом репликоны, содержащие «старую» и «новую» копию мобильного элемента сливаются (образуется коинтеграт). Коинтеграты разрешаются (разрезаются) на 2 репликона в рекомбинационном res-сайте ферментом резолвазой. Старая и новая копии мобильного элемента в коинтеграте находятся в одной ориентации, и разрешение коинтеграта идет через сложную фигуру, напоминающую восьмерку. В результате снова образуется 2 репликона, но теперь каждый из них несет копию мобильного элемента. Реакция относится к сайт-специфической рекомбинации. Репликативный механизм транспозиции распространен сравнительно мало. Он обнаружен у мобильного элемента Is6, фага Mu и бактериальных транспозонов семейства Tn3 с короткими ИП.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_11.jpg" alt=">Структура транспозона Tn3">
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_12.jpg" alt=">">
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_13.jpg" alt=">Транспозон Tn3 представляет семейство мобильных элементов с короткими ИП (35-50 п.н.), перемещающимися с помощью"> Транспозон Tn3 представляет семейство мобильных элементов с короткими ИП (35-50 п.н.), перемещающимися с помощью репликативной транспозиции и образующими ДПП из 5 п.н. У самого Tn3 центральная часть содержит гены транспозазы, резолвазы и бета-лактамазы bla (обеспечивает устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда). Ген транспозазы tnA кодирует большой белок из примерно 1000 а.о., ген резолвазы tnR кодирует белок из 185 а.о. Гены транспозазы и резолвазы транскрибируются в противоположных направлениях с промоторов, расположенных в межгенном пространстве длиной 170 п.н. В межгенном пространстве находится и сайт res, по которому происходит разрешение коинтегратов. Транскрипции генов резолвазы и транспозазы конкурируют друг с другом, и ген резолвазы выступает как ген-регулятор гена транспозазы. К семейству Tn3 относятся Tn1, Tn1000 и др.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_14.jpg" alt=">Большинство прокариотических мобильных элементов перемещается с помощью нерепликативной транспозиции. Нерепликативная транспозиция заключается в"> Большинство прокариотических мобильных элементов перемещается с помощью нерепликативной транспозиции. Нерепликативная транспозиция заключается в вырезании элемента и его перемещении в новое место. При этом 2 молекулы транспозазы связываются с концами мобильного элемента и делают разрывы одновременно в обеих цепях ДНК на концах мобильного элемента и в ДНК-мишени. Далее транспозаза сводит вместе концы мобильного элемента и ДНК-мишень, 3-OH-концы элемента соединяются с 5-Р-концами ДНК-мишени, а между 3’-OH-концами ДНК-мишени и 5’-Р- концами элемента образуется брешь, которая заполняется с помощью репаративного синтеза ДНК, в результате чего на концах мобильного элемента возникают ДПП строго фиксированной длины. В исходном репликоне остается ДНР. Будет ли он репарирован – зависит хозяйской клетки. Этот механизм характерен для большинства мобильных элементов бактерий и эукариотических элементов с короткими ИП. По такому типу перемещаются многие IS-элементы и мобильные элементы, которые называют составными: Tn5, Tn9, Tn10 и другие. Составные транспозоны отличаются тем, что у них инвертированные повторы представлены IS-элементами, которые находятся в обратной или (гораздо реже, например, Tn9) в прямой ориентации.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_15.jpg" alt=">МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ ЭУКАРИОТ Мобильные элементы эукариот значительно разнообразнее прокариотических элементов. У эукариот распространены"> МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ ЭУКАРИОТ Мобильные элементы эукариот значительно разнообразнее прокариотических элементов. У эукариот распространены разнообразные мобильные элементы как прокариотического типа, так и элементы, встречающиеся только у эукариот, – ретроэлементы или ретротранспозоны. Элементы прокариотического типа с короткими ИП (класс II.1) характерны для растений и дрозофилы. Элементы с длинными ИП (класс II.2) у эукариот встречаются редко. Элементы с короткими ИП (класс II.1) содержат транспозазу и перемещаются путем нерепликативной транспозии, но отличаются прокариотических мобильных элементов некоторыми особенностями, специфичными для эукариотических элементов, например, наличием у многих из них интронов. ДНК-транспозоны эукариот делают ДПП различной длины, специфичной для каждого элемента.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_16.jpg" alt=">Примерами мобильных элементов класса II.1 у дрозофилы являются элементы Р и hobo. Р-элемент содержится"> Примерами мобильных элементов класса II.1 у дрозофилы являются элементы Р и hobo. Р-элемент содержится в количестве 30-50 копий на геном. Его размер примерно 3 т.п.н., ИП из 31 п.н., ДПП – 8 п.н. Ген транспозазы в центральной части элемента содержит 3 интрона и 4 экзона и экспрессируется с использованием альтернативного сплайсинга. В соматических клетках из первых трех экзонов формируется укороченная мРНК, с нее транслируется полипептид размером 66 kDa, который является репрессором транспозазы. В генеративных клетках образуется полноразмерный транскрипт из 4 экзонов и, соответственно, полноразмерный белок – транспозаза. Таким образом, транспозиция Р-элемента происходит только в клетках зародышевой линии.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_17.jpg" alt=">К этому же типу транспозонов относятся многие мобильные элементы растений: элементы Spm кукурузы, Tgm1"> К этому же типу транспозонов относятся многие мобильные элементы растений: элементы Spm кукурузы, Tgm1 сои, Tam1 и Tam2 львиного зева и др. Отметим двухкомпонентную систему Ac/Ds кукурузы (это самый первый обнаруженный мобильный элемент, описанную Барбарой Мак-Клинток): она включает автономно транспозирующийся элемент Ас (4565 п.н., ИП из 11 п.н., ДПП из 8 п.н., ген транспозазы содержит 4 интрона) и гетерогенные по длине элементы Ds, которые являются делетированными производными Ас-элемента и перемещаются с помощью его транспозазы.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_18.jpg" alt=">Классификация эукариотических мобильных элементов">
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_19.jpg" alt=">">
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_20.jpg" alt=">У эукариот широко распространены ретротранспозоны, в транспозициях которых задействованы фермент обратная транскриптаза (ревертаза) и"> У эукариот широко распространены ретротранспозоны, в транспозициях которых задействованы фермент обратная транскриптаза (ревертаза) и РНК-копия элемента в качестве интермедиата. Ретроэлементы подразделяются на 2 группы: Ретротранспозоны с длинными прямыми концевыми повторами (ДКП) (класс I.1). Их структура соответствует ДНК-копиям геномов ретровирусов позвоночных, которые также являются мобильными элементами. Ретроэлементы (класс I.2), не содержащие повторов на концах (некоторые авторы используют для них название «ретропозоны»).
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_21.jpg" alt=">Ретровирусы являются «прототипами» ретротранспозонов. Их цикл развития состоит из чередования РНК- и ДНК-стадий. Вирионный"> Ретровирусы являются «прототипами» ретротранспозонов. Их цикл развития состоит из чередования РНК- и ДНК-стадий. Вирионный геном представлен РНК размером обычно 5-6 т.п.н. с короткими прямыми повторами. Когда ретровирус проникает в клетку хозяина, то с помощью кодируемой им обратной транскриптазы на матрице его РНК синтезируется ДНК-копия, но уже с ДКП (в англоязычной литературе LTR – long terminal repeats) длиной обычно 200-400 п.н. ДКП содержат двунуклеотидные инвертированные повторы на концах и еще ряд повторов на некотором расстоянии от концов, разнообразные регуляторные элементы (промоторы и терминаторы и энхансеры транскрипции). Наличием регуляторных элементов в ДКП обусловлены различные эффекты ретровирусов и ретротранспозонов, встроенных в хромосомы, на экспрессию соседних генов. Центральная часть ретровируса содержит 3 кодирующие рамки: gag – кодирует структурный белок вирионного капсида; pol – кодирует сложный полипептид, в котором слиты домены интегразы (ответственна за интеграцию ДНК-копии в хозяйский геном; интеграза соответствует транспозазе других подвижных элементов), обратной транскриптазы (ревертазы), РНКазы H (RNAse H удаляет РНК из гибрида ДНК-РНК) и протеазы (после транскрипции слитого полипептида протеаза «нарезает» его на отдельные функциональные полипептиды). Env – белки хвостового отростка вируса, которые ответственны за адсорбцию ретровируса на поверхности клетки-хозяина и, соответственно, его вирулентность. Большинство ретровирусов не содержат гена env и, следовательно, неинфекционны.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_22.jpg" alt=">В последние годы А. И. Ким и др. открыли, что мобильный элемент МДГ-4 (gypsy),"> В последние годы А. И. Ким и др. открыли, что мобильный элемент МДГ-4 (gypsy), содержит ген env и обладает инфекционными свойствами. Затем французские исследователи выявили у дрозофилы аналогичные элементы ZAM, Idefix и др., всего более 10. Таким образом, стало известно, что ретровирусы встречаются не только у позвоночных животных. Новые вирусы выделены в отдельную группу Errantiviruses – эндогенные ретровирусы беспозвоночных. У многих ретровирусов рамки считывания gag и pol перекрываются (а иногда они «сливаются» в общий транскрипт). Транспозоны из обеих групп встречаются среди всех групп живых организмов – от дрожжей до человека. Ретротранспозоны всегда делают в ДНК-мишени ДПП из 5 п.н.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_23.jpg" alt=">У ретроэлементов с ДКП транспозиция происходит по схеме, включающей РНК-интермедиат. С геномной ДНК"> У ретроэлементов с ДКП транспозиция происходит по схеме, включающей РНК-интермедиат. С геномной ДНК элемента транскрибируется РНК-копия, но уже с короткими концевыми повторами, с нее путем обратной транскрипции синтезируется ДНК-копия с ДКП, которая встраивается в новое место с помощью интегразы. Интеграция ретротранспозонов с ДКП происходит по механизму, идентичному с нерепликативной транспозицией у прокариот. Интегразы ретротранспозонов, несмотря на различие в названиях, полностью соответствуют транспозазам. Характерно, что структура каталитического центра интегразы ретровируса человеческого иммунодефицита HIV-1 очень сходна с таковой у транспозазы прокариотического элемента Is3. Сходная ситуация наблюдается между интегразой вируса птичьей саркомы ASV и транспозазами Is50 и Mu. Рекомбинация у ретроэлементов без концевых повторов менее изучена, но она также осуществляется через РНК-интермедиат.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_24.jpg" alt=">">
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_25.jpg" alt=">Элементы без длинных концевых последовательностей: LINE и SINE "> Элементы без длинных концевых последовательностей: LINE и SINE Другая группа ретротранспозонов – элементы класса I.2 (ретропозоны). Их размер – тоже около 5-6 т.п.н., но на концах они не имеют повторов. На 3’-конце они содержат небольшую последовательность поли-A. Прямых повторов в ДНК-мишени они либо не образуют, либо делают не всегда, и, если делают, то нерегулярной длины. Ретротранспозоны класса II можно разделяют на 2 типа: LINE (long interspersed nuclear elements) и SINE (short interspersed nuclear elements) – длиной 200-300 п.н., которые не кодируют никаких белков и не способны к самостоятельному перемещению, а перемещаются, по-видимому, за счет элементов LINE.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_26.jpg" alt=">Структура LINE-элементов">
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_27.jpg" alt=">LINE-элементы широко распространены как у беспозвоночных, так и у позвоночных. У млекопитающих LINE и"> LINE-элементы широко распространены как у беспозвоночных, так и у позвоночных. У млекопитающих LINE и SINE являются преобладающим типом мобильных элементов. Особенно много в геноме позвоночных так называемых Alu-повторов (SINE-элементы, получившие свое название от рестриктазы AluI), которые представлены сотнями тысяч копий на геном и, в случае генома человека, составляют 5% геномной ДНК. LINE-элементы состоят из 5’-нетранслируемой области, центральной части и 3’-нетранслируемой области. На конце 3’-нетранслируемой области находится короткая последовательность поли-A или поли-TAA. Центральная часть содержит гены обратной транскриптазы, РНКазы H и эндонуклеазы (EN), но не содержит ни гена интегразы, ни гена протеазы, так как механизм перемещения LINE-элементов резко отличается от механизма перемещения ретротранспозонов класса I.1.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_28.jpg" alt=">Механизм перемещения LINE- и SINE-элементов представлен на рисунке. В отличие от ретротранспозонов I типа,"> Механизм перемещения LINE- и SINE-элементов представлен на рисунке. В отличие от ретротранспозонов I типа, здесь реакцию интеграции в хозяйский геном инициируетет РНК-копия элемента. Эндонуклеаза делает ступенчатые ОНР в ДНК-мишени и РНК-копия прикрепляется к концу ДНК-мишени в точке разрыва. На матрице РНК-копии с помощью обратной транскриптазы строится ее ДНК-копия. Свободная группа 3’-OH в точке разрыва используется как праймер для обратной транскриптазы. Потом РНК-копия удаляется с помощью РНКазы H, клеточная репаративная система достраивает вторую цепь ДНК, которая оказывается интегрирированной в реципиентную ДНК. При этом на концах встроенного элемента могут возникать ДПП различной длины. SINE-элементы не способны к самостоятельной транспозиции и используют соответствующий аппарат LINE. Рассмотренный процесс принципиально отличается от других механизмов не только транспозиции, но и других типов рекомбинации вообще тем, что здесь не происходит расщепления ДНК на концах элемента и не происходит обмена цепями ДНК.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_29.jpg" alt=">Перемещение мобильного элемента LINE-типа">
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_30.jpg" alt=">Мобильные ретроэлементы имеют большое биологическое значение. Как и все мобильные элементы, они вызывают"> Мобильные ретроэлементы имеют большое биологическое значение. Как и все мобильные элементы, они вызывают хромосомные перестройки и инактивируют гены путем встраивания в экзоны генов. У дрозофилы на долю транспозиций приходится примерно половина спонтанных мутаций. Вероятно это имеет место и у других организмов. Мобильные элементы оказывают различные регуляторные эффекты. Например, если ретроэлемент встраивается в интрон, то он может влиять на ход транскрипции. Такая ситуация описана для гена white дрозофилы. У мутанта wa ретротранспозон встроился во второй интрон, что привело к возникновению целого набора альтернативных транскриптов. Соответственно, полной инактивации гена не произошло, и получились глаза абрикосового цвета. Другой пример – гомеозисная мутация antennapedia у дрозофилы. В этом случае мобильный элемент также встроился во второй интрон гена, и изменение экспрессии гена привело к тому, что вместо антенн получились дополнительные конечности. У позвоночных ретроэлементам приписывают важную роль в индукции канцерогенеза. Они могут встраиваться в хромосому перед протоонкогенами и за счет своих регуляторных элементов активировать протоонкогены, чем стимулируют неконтролируемое клеточное деление. Протоонкогены – это гены, которые работают только на ранних стадиях развития (в основном это гены регуляции клеточного цикла), а потом они должны замолчать.
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_31.jpg" alt=">У представителей рода Drosophila, D.melanogaster и D.virilis теломеры, в отличие от других организмов, формируются"> У представителей рода Drosophila, D.melanogaster и D.virilis теломеры, в отличие от других организмов, формируются путем последовательных транспозиций двух элементов LINE-типа: HeT-A и TART. Ретровирус HIV-1 вызывает у человека синдром иммунодефицита. Гомеозисная мутация antennapedia
Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_32.jpg" alt=">На долю подвижных элементов у эукариот приходится значительная часть генома: у дрозофилы – 20%,"> На долю подвижных элементов у эукариот приходится значительная часть генома: у дрозофилы – 20%, у человека – около половины. Перемещение мобильных элементов находится под жестким контролем как со стороны самих элементов, так, по-видимому, и со стороны организмов-хозяев. Частота транспозиции достаточно низка – в среднем 10-4-10-7 транспозиций на клетку за клеточную генерацию.
Попытки отсеквенировать геном гигантской серной бактерии Achromatium oxaliferum дали парадоксальный результат: оказалось, что каждая бактериальная клетка содержит не один, а множество различающихся геномов. Уровень внутриклеточного генетического разнообразия A. oxaliferum сопоставим с разнообразием многовидового бактериального сообщества. По-видимому, различающиеся хромосомы размножаются в разных участках цитоплазмы, подразделенной крупными кальцитовыми включениями на множество слабо сообщающихся отсеков (компартментов). Важную роль в поддержании внутреннего генетического разнообразия играют многочисленные мобильные генетические элементы, способствующие переносу генов с хромосомы на хромосому. Авторы открытия предполагают, что естественный отбор у этого уникального организма идет не столько на уровне клеток, сколько на уровне отдельных компартментов внутри одной гигантской клетки.
1. Загадочная бактерия
Гигантская серная бактерия Achromatium oxaliferum была открыта еще в XIX веке, однако ее биология до сих пор остается загадочной - во многом потому, что ахроматиум не поддается культивированию в лаборатории. Клетки ахроматиума могут достигать 0,125 мм в длину, что делает его крупнейшей из пресноводных бактерий (в морях есть еще более крупные серные бактерии, такие как Thiomargarita , о которой рассказано в новости Древнейшие докембрийские эмбрионы оказались бактериями? , «Элементы», 15.01.2007).
Achromatium oxaliferum живет в донных осадках пресных озер, где он обычно встречается на границе кислородной и бескислородной зон, но проникает и в полностью бескислородные слои. Другие разновидности (или виды) ахроматиума обитают в минеральных источниках и в соленых осадках приливно-отливных маршей .
Ахроматиум получает энергию за счет окисления сероводорода сначала до серы (которая хранится в виде гранул в цитоплазме), а затем и до сульфатов. Он способен к фиксации неорганического углерода, но может усваивать и органические соединения. Неясно, способен ли он обходиться только автотрофным метаболизмом или ему необходима органическая подкормка.
Уникальной особенностью ахроматиума является наличие в его клетках многочисленных крупных включений коллоидного кальцита (рис. 1). Зачем это нужно бактерии и какую роль играет карбонат кальция в его метаболизме, точно не известно, хотя есть правдоподобные гипотезы (V. Salman et al., 2015. Calcite-accumulating large sulfur bacteria of the genus Achromatium in Sippewissett Salt Marsh).
Цитоплазма ахроматиума ютится в просветах между кальцитовыми гранулами, которые фактически подразделяют ее на множество сообщающихся отсеков (компартментов). Хотя отсеки и не изолированы полностью, обмен веществом между ними, по-видимому, затруднен, тем более что у прокариот гораздо слабее, чем у эукариот, развиты системы активного внутриклеточного транспорта.
И вот теперь выяснилось, что кальцитовые гранулы - не единственная уникальная особенность ахроматиума. И даже не самая поразительная. В статье, опубликованной в журнале Nature Communications , немецкие и британские биологи сообщили о парадоксальных результатах, к которым привели попытки прочесть геномы индивидуальных клеток A. oxaliferum из донных отложений озера Штехлин (Stechlin) на северо-востоке Германии. Результаты эти настолько необычны, что в них трудно поверить, хотя оснований сомневаться в их достоверности, по-видимому, нет: работа выполнена в методологическом отношении очень тщательно.
2. Подтверждение полиплоидности
Хотя ахроматиум, как уже говорилось, относится к некультивируемым бактериям, это неудобство отчасти компенсируется гигантскими размерами клеток. Их отлично видно в световой микроскоп даже при небольшом увеличении, и их можно отбирать вручную из проб донных осадков (предварительно пропущенных через фильтр, чтобы удалить крупные частицы). Именно так авторы и собирали материал для своего исследования. Клетки A. oxaliferum покрыты органическим чехлом, на поверхности которого кишат разнообразные сожители - мелкие бактерии. Всю эту сопутствующую микробиоту авторы тщательно смывали с отобранных клеток, чтобы уменьшить долю посторонней ДНК в пробах.
Для начала исследователи покрасили клетки ахроматиума специальным флуоресцентным красителем для ДНК, чтобы понять, сколько в клетке генетического материала и как он распределен. Оказалось, что молекулы ДНК не приурочены к какому-то одному участку цитоплазмы, а образуют множество (в среднем около 200 на клетку) локальных скоплений в просветах между гранулами кальцита (рис. 1, b, d).
Учитывая всё, что известно на сегодняшний день о крупных бактериях и их генетической организации, этого факта уже достаточно, чтобы считать доказанным, что A. oxaliferum является полиплоидом, то есть в каждой его клетке содержится не одна, а множество копий генома.
Впрочем, задним числом и так понятно, что такая огромная прокариотическая клетка не могла бы обойтись единственной копией. Ее бы просто не хватило, чтобы обеспечить всю клетку необходимыми для синтеза белка транскриптами .
Судя по тому, что скопления ДНК различаются по яркости флуоресценции, эти скопления, скорее всего, содержат разное количество хромосом. Здесь нужно оговориться, что обычно весь геном прокариотической клетки помещается на одной кольцевой хромосоме. Для ахроматиума это не доказано, но весьма вероятно. Поэтому авторы для простоты пользуются термином «хромосома» как синонимом термина «одна копия генома», и мы поступим так же.
На данном этапе ничего сенсационного еще не было обнаружено. Прошли те времена, когда все думали, что у прокариот всегда или почти всегда только одна кольцевая хромосома в каждой клетке. Сегодня уже известно много видов полиплоидных бактерий и архей (см. , «Элементы», 14.06.2016).
3. Метагеном многовидового сообщества - в одной клетке
Чудеса начались, когда авторы приступили к выделению ДНК из отобранных и отмытых клеток и к секвенированию. Из 10 000 клеток был получен метагеном (см. Метагеномика), то есть множество (около 96 млн) коротких отсеквенированных случайных фрагментов хромосом (ридов), принадлежащих разным индивидуумам и в совокупности дающих представление о генетическом разнообразии популяции.
Затем исследователи приступили к секвенированию ДНК из индивидуальных клеток. Сначала из 27 клеток были выделены фрагменты гена 16s-рРНК, по которому принято классифицировать прокариот и по которому обычно определяют присутствие того или иного вида микробов в анализируемой пробе. Практически все выделенные фрагменты принадлежали ахроматиуму (то есть примерно совпадали с последовательностями 16s-рРНК ахроматиума, уже имеющимися в генетических базах данных). Из этого следует, что изучаемая ДНК не была загрязнена генетическим материалом каких-то посторонних бактерий.
Оказалось, что каждая клетка A. oxaliferum, в отличие от подавляющего большинства других прокариот, содержит не один, а несколько различающихся вариантов (аллелей) гена 16s-рРНК. Точное число вариантов определить трудно, потому что мелкие различия могут объясняться ошибками секвенирования, а если считать «разными» только сильно различающиеся фрагменты, то встает вопрос, насколько сильно они должны различаться. С использованием самых строгих критериев получилось, что в каждой клетке присутствует примерно 4–8 разных аллелей гена 16s-рРНК, причем это минимальная оценка, а на самом деле их, скорее всего, больше. Это резко контрастирует с ситуацией, характерной для других полиплоидных прокариот, у которых, как правило, на всех хромосомах одной клетки сидит один и тот же вариант данного гена.
Более того, оказалось, что аллели гена 16s-рРНК, присутствующие в одной и той же клетке A. oxaliferum , нередко образуют весьма далекие друг от друга веточки на общем генеалогическом дереве всех вариантов этого гена, обнаруженных (ранее и сейчас) у A. oxaliferum. Иными словами, аллели 16s-рРНК из одной клетки не более родственны друг другу, чем аллели, взятые наугад из разных клеток.
Наконец, авторы провели тотальное секвенирование ДНК из шести индивидуальных клеток. Для каждой клетки было прочтено примерно по 12 млн случайных фрагментов - ридов. В нормальной ситуации этого с избытком хватило бы, чтобы при помощи специальных компьютерных программ собрать из ридов, используя их перекрывающиеся части, шесть весьма качественных (то есть прочтенных с очень высоким покрытием, см. Coverage) индивидуальных геномов.
Но не тут-то было: хотя практически все риды бесспорно принадлежали ахроматиуму (примесь посторонней ДНК была пренебрежимо малой), прочтенные фрагменты наотрез отказались собираться в геномы. Дальнейший анализ прояснил причину неудачи: оказалось, что фрагменты ДНК, выделенные из каждой клетки, в действительности принадлежат не одному, а множеству довольно сильно различающихся геномов. Фактически то, что авторы получили из каждой отдельной клетки, представляет собой не геном, а метагеном. Подобные наборы ридов обычно получают при анализе не одного организма, а целой популяции, обладающей к тому же высоким уровнем генетического разнообразия.
Этот вывод был подтвержден несколькими независимыми способами. В частности, известны десятки генов, которые практически всегда присутствуют в бактериальных геномах в единственном экземпляре (single copy marker genes). Эти однокопийные маркерные гены широко используются в биоинформатике для проверки качества сборки геномов, оценки числа видов в метагеномных пробах и других подобных задач. Так вот, в геномах (или «метагеномах») индивидуальных клеток A. oxaliferum большая часть этих генов присутствует в виде нескольких различающихся копий. Как и в случае с 16s-рРНК, аллели этих однокопийных генов, находящиеся в одной клетке, как правило, не более родственны друг другу, чем аллели из разных клеток. Уровень внутриклеточного генетического разнообразия оказался сопоставим с уровнем разнообразия всей популяции, оцененным на основе метагенома 10 000 клеток.
Современная метагеномика уже располагает методами, позволяющими из множества разнородных обрывков ДНК, обнаруженных в пробе, выделить фрагменты, с большой вероятностью принадлежащие одному и тому же геному. Если таких фрагментов наберется достаточно много, то из них можно собрать значительную часть генома и даже полный геном. Именно таким способом недавно был открыт и подробно охарактеризован новый надтип архей - асгардархеи (см. Описан новый надтип архей, к которому относятся предки эукариот , «Элементы», 16.01.2017). Авторы применили эти методы к «метагеномам» индивидуальных клеток A. oxaliferum. Это позволило выявить в каждом «метагеноме» по 3–5 наборов генетических фрагментов, соответствующих, скорее всего, индивидуальным кольцевым геномам (хромосомам). Или, скорее, каждый такой набор соответствует целой группе похожих друг на друга геномов. Число различающихся геномов в каждой клетке A. oxaliferum скорее всего больше, чем 3–5.
Уровень различий между геномами, присутствующими в одной и той же клетке A. oxaliferum , примерно соответствует межвидовому: бактерии с таким уровнем различий, как правило, относятся к разным видам одного рода. Иными словами, генетическое разнообразие, присутствующее в каждой отдельной клетке A. oxaliferum, сопоставимо даже не с популяцией, а с многовидовым сообществом. Если бы ДНК из одной-единственной клетки ахроматиума анализировали современными методами метагеномики «вслепую», не зная, что вся эта ДНК происходит из одной клетки, то анализ бы однозначно показал, что в пробе присутствует несколько видов бактерий.
4. Внутриклеточный перенос генов
Итак, у A. oxaliferum обнаружен принципиально новый, прямо-таки неслыханный тип генетической организации. Безусловно, открытие порождает массу вопросов, и прежде всего вопрос «как такое вообще может быть?!»
Не будем рассматривать самый неинтересный вариант, состоящий в том, что всё это - результат грубых ошибок, допущенных исследователями. Если так, мы скоро об этом узнаем: Nature Communications - журнал серьезный, исследование захотят повторить другие коллективы, так что вряд ли опровержение заставит себя долго ждать. Гораздо интереснее обсудить ситуацию, исходя из допущения, что исследование проведено тщательно и результат достоверен.
В таком случае нужно прежде всего попытаться выяснить причины обнаруженного у A. oxaliferum беспрецедентного внутриклеточного генетического разнообразия: как оно формируется, почему оно сохраняется, и как сам микроб при этом ухитряется выжить. Все эти вопросы - очень непростые.
У всех остальных изученных на сегодняшний день полиплоидных прокариот (в том числе у известной читателям «Элементов» солелюбивой археи Haloferax volcanii ) все копии генома, присутствующие в клетке, сколько бы их ни было, очень похожи друг на друга. Ничего похожего на колоссальное внутриклеточное разнообразие, обнаруженное у A. oxaliferum, у них не наблюдается. И это отнюдь не случайность. Полиплоидность дает прокариотам ряд преимуществ, однако она способствует бесконтрольному накоплению рецессивных вредных мутаций, что в конечно счете может привести к вымиранию (подробнее см. в новости Полиплоидность предков эукариот - ключ к пониманию происхождения митоза и мейоза , «Элементы», 14.06.2016).
Чтобы избежать накопления мутационного груза, полиплоидные прокариоты (и даже полиплоидные пластиды растений) активно используют генную конверсию - асимметричный вариант гомологичной рекомбинации , при котором два аллеля не меняются местами, переходя с хромосомы на хромосому, как при кроссинговере , а один из аллелей замещается другим. Это ведет к унификации хромосом. Благодаря интенсивной генной конверсии вредные мутации либо быстро «затираются» неиспорченной версией гена, либо переходят в гомозиготное состояние, проявляются в фенотипе и отбраковываются отбором.
У A. oxaliferum генная конверсия и унификация хромосом, скорее всего, тоже происходят, но не в масштабах всей клетки, а на уровне отдельных «компартментов» - просветов между гранулами кальцита. Поэтому в разных частях клетки накапливаются разные варианты генома. Авторы проверили это при помощи избирательного окрашивания разных аллельных вариантов гена 16s-рРНК (см. Fluorescent in situ hybridization). Выяснилось, что в разных частях клетки концентрация разных аллельных вариантов действительно различается.
Впрочем, этого еще недостаточно, чтобы объяснить высочайший уровень внутриклеточного генетического разнообразия, обнаруженный у A. oxaliferum . Авторы видят его главную причину в высоких темпах мутагенеза и внутриклеточных геномных перестроек. Сравнение фрагментов хромосом из одной и той же клетки показало, что эти хромосомы, по-видимому, живут очень бурной жизнью: постоянно мутируют, перестраиваются и обмениваются участками. У A. oxaliferum из озера Штехлин резко повышено число мобильных генетических элементов по сравнению с другими бактериями (в том числе и с ближайшими родственниками - ахроматиумами из соленых маршей, у которых уровень внутриклеточного разнообразия, судя по предварительным данным, гораздо ниже). Активность мобильных элементов способствует частым геномным перестройкам и переносу участков ДНК с одной хромосомы на другую. Авторы даже придумали для этого специальный термин: «внутриклеточный перенос генов» (intracellular gene transfer, iGT), по аналогии со всем известным горизонтальным переносом генов (HGT).
Одно из ярких свидетельств частых перестроек в хромосомах A. oxaliferum - различающийся порядок генов в разных версиях генома, в том числе и в пределах одной клетки. Даже в некоторых консервативных (редко меняющихся в ходе эволюции) оперонах отдельные гены иногда располагаются в разной последовательности на разных хромосомах в пределах одной клетки.
На рисунке 2 схематично показаны основные механизмы, которые, по мнению авторов, создают и поддерживают высокий уровень внутриклеточного генетического разнообразия у A. oxaliferum .
5. Внутриклеточный отбор
Частые перестройки, внутриклеточный перенос генов, высокий темп мутагенеза - даже если всё это и может худо-бедно объяснить высокое внутриклеточное генетическое разнообразие (а я думаю, что не может, об этом мы поговорим ниже), то остается неясным, как ухитряется ахроматиум в таких условиях сохранять жизнеспособность. Ведь подавляющее большинство ненейтральных (влияющих на приспособленность) мутаций и перестроек должны быть вредными! Полиплоидные прокариоты и без того обладают повышенной склонностью к накоплению мутационного груза, а если мы допустим еще и сверхвысокие темпы мутагенеза, становится и вовсе непонятно, как такая тварь, как ахроматиум, может существовать.
И тут авторы выдвигают поистине новаторскую гипотезу. Они предполагают, что естественный отбор у ахроматиума действует не столько на уровне целых клеток, сколько на уровне отдельных компартментов - слабо сообщающихся просветов между гранулами кальцита, в каждом из которых, наверное, размножаются свои варианты генома.
На первый взгляд предположение может показаться диким. Но если подумать, почему бы и нет? Для этого достаточно допустить, что каждая хромосома (или каждое локальное скопление похожих хромосом) имеет ограниченный «радиус действия», то есть белки, закодированные в этой хромосоме, синтезируются и работают в основном в ее ближайших окрестностях, а не размешиваются равномерно по всей клетке. Скорее всего, так оно и есть. В таком случае те компартменты, где находятся более удачные хромосомы (содержащие минимум вредных и максимум полезных мутаций), будут быстрее реплицировать свои хромосомы, их будет становиться больше, они начнут распространяться внутри клетки, постепенно вытесняя менее удачные копии генома из соседних компартментов. Вообразить такое в принципе можно.
6. Внутриклеточное генетическое разнообразие нуждается в дополнительных объяснениях
Идея об интенсивном внутриклеточном отборе геномов, отвечая на один вопрос (почему ахроматиум не вымирает при таком высоком темпе мутагенеза), тут же создает другую проблему. Дело в том, что благодаря такому отбору более удачные (быстрее реплицирующиеся) копии генома должны вытеснять внутри клетки менее удачные копии, неизбежно снижая при этом внутриклеточное генетическое разнообразие. То самое, которое мы с самого начала хотели объяснить.
Более того, очевидно, что внутриклеточное генетическое разнообразие должно резко снижаться при каждом клеточном делении. Разные хромосомы сидят в разных компартментах, поэтому при делении каждая дочерняя клетка получит не все, а только некоторые варианты генома, имеющиеся у материнской клетки. Это видно даже на рис. 2.
Внутриклеточный отбор плюс компартментализация геномов - два мощных механизма, которые должны сокращать внутреннее разнообразие настолько быстро, что никакой мыслимый (совместимый с жизнью) темп мутагенеза не сможет этому противостоять. Таким образом, внутриклеточное генетическое разнообразие остается необъясненным.
Обсуждая полученные результаты, авторы неоднократно ссылаются на нашу работу, о которой рассказано в новости Полиплоидность предков эукариот - ключ к пониманию происхождения митоза и мейоза . В частности, они упоминают, что полиплоидным прокариотам очень полезно обмениваться генетическим материалом с другими клетками. Однако они полагают, что в жизни ахроматиума межклеточный генетический обмен не играет большой роли. Это обосновывается тем, что в метагеноме ахроматиума хотя и обнаружены гены для поглощения ДНК из внешней среды (трансформации, см. Transformation), но нет генов для конъюгации (см. Bacterial conjugation).
На мой взгляд, генетическая архитектура ахроматиума указывает не на конъюгацию, а на более радикальные способы смешивания генетического материала разных особей, такие как обмен целыми хромосомами и слияние клеток. Судя по полученным данным, с генетической точки зрения клетка A. oxaliferum представляет собой нечто вроде прокариотического плазмодия или синцития, вроде тех, что образуются в результате слияния множества генетически разнородных клеток у слизевиков . Напомним, что ахроматиум - бактерия некультивируемая, поэтому не исключено, что какие-то элементы ее жизненного цикла (такие как периодическое слияние клеток) могли ускользнуть от внимания микробиологов.
В пользу того, что внутриклеточное генетическое разнообразие ахроматиума формируется не внутриклеточно, свидетельствует один из главных фактов, обнаруженных авторами, а именно то, что находящиеся в одной клетке аллели многих генов образуют далекие друг от друга ветви на филогенетическом дереве. Если бы всё внутриклеточное разнообразие аллелей формировалось внутри клонально размножающихся клеток, не меняющихся друг с другом генами, то следовало бы ожидать, что аллели в пределах клетки будут более родственны друг другу, чем аллели из разных клеток. Но авторы убедительно показали, что это не так. В общем, я бы поставил на то, что в жизненном цикле ахроматиума присутствует слияние клеток. Это представляется самым экономным и правдоподобным объяснением колоссального внутриклеточного генетического разнообразия.
В заключительной части статьи авторы намекают, что генетическая архитектура ахроматиума может пролить свет на происхождение эукариот. Они формулируют это так: «Между прочим, Марков и Казначеев предположили, что, подобно ахроматиуму из озера Штехлин, клетки прото-эукариот могли быть быстро мутирующими, разнообразящими свои хромосомы, полиплоидными бактериями/археями ». Совершенно верно, но мы также показали, что такое существо не могло бы выжить без интесивного межорганизменного генетического обмена. Будем надеяться, что дальнейшие исследования прольют свет на оставшиеся неразгаданными загадки ахроматиума.
