Toll подобные рецепторы при иммунопатологии. Толл- и толл-подобные рецепторы как компоненты рекогносцировочного аппарата иммунной системы

В данной обзорной статье рассматриваются основные понятия о мембраносвязанных рецепторах врожденного иммунитета – Толл-подобных рецепторах, основные методы определения их экспрессии, применяемые в клинических исследованиях, а также полученные с их помощью результаты. Перспективы будущих исследований основаны на получении полной информации о функционировании систе­мы TLR , также необходима комплексная оценка всех ее звеньев. Это позволит уточнить и ло­кализовать молекулярные дефекты нарушений в системе врожденного иммунитета, а также оценить их роль в патогенезе широкого круга заболеваний.

И ндивидуальная восприимчивость организма к инфекциям определяется патогенностью микроорганизмов, факторами окружающей среды и состоянием иммунной системы . Защита на местном уровне после инфицирования осуществляется прежде всего типичной воспалительной реакцией, которая направлена на распознавание и уничтожение патогена и его компонентов. В- и Т-лимфоциты, осуществляющие адаптивный иммунный ответ, распознают патогены, используя высокоаффинные рецепторы. Однако развитие адаптивного иммунитета обычно происходит достаточно медленно, так как предполагает активацию, пролиферацию лимфоцитов и синтез ими белков: цитокинов и иммуноглобулинов. Более быстрое развитие иммунных реакций обеспечивается врожденным иммунным ответом, который распознает патогены при помощи специальных рецепторов более широкой специфичности, чем рецепторы лимфоцитов. Эти рецепторы распознают молекулярные структуры, общие для целых групп инфекционных возбудителей, в первую очередь к ним относятся Толл-подобные рецепторы (TLR). TLR взаимодействуют с молекулярными структурами, которые не существуют у человека, но присутствуют на патогенах . TLR широко распространены в клетках макроорганизма. Они индуцируют активацию и экспрессию специфических генов, экспрессия которых контролирует механизмы, обеспечивающие деструкцию внедряющихся патогенов. В результате активации через TLR возникает широкий спектр биологических реакций – от индукции синтеза провоспалительных цитокинов и интерферонов (обеспечивающих реализацию реакций врожденного иммунитета) до экспрессии костимулирующих молекул, которые способствуют активации Т-лимфоцитов и стимулируют развитие адаптивного иммунного ответа .

Широкий спектр лигандов TLR и представленность этих рецепторов на многих клетках способствуют вовлечению TLR в патогенез многих забо­леваний. Дефекты в системе TLR, такие как нару­шения распознавания лигандов, экспрессии TLR, трансдукции сигнала, выработки эффекторных мо­лекул, а также полиморфизм генов TLR могут при­водить к развитию тяжелых инфекционных заболе­ваний (сепсис, менингит), аутоиммунных заболе­ваний, атеросклероза, аллергопатологии . Дефекты молекул, участвующих в трансдукции сигнала от TLR, лежат в основе повышенной чув­ствительности к инфекциям. Так, дети с мутацией в гене, кодирующем IRAK-4-киназу, с раннего воз­раста страдают тяжелыми пиогенными инфекция­ми, вызванными грамположительными микроорга­низмами . В то же время чрезмерная активация сигнального каскада от TLR ассоциирована с раз­витием сепсиса, воспалительных заболеваний ки­шечника, может вызывать деструкцию тканей. Количество выявленных связей различных патологий с нару­шениями в системе TLR растет. В свя­зи с этим необходимы адекватные и надежные методы оценки компонен­тов системы TLR для выявления иммунодефицитных состояний, связанных с нарушениями функциональной актив­ности TLR, которые могут быть вос­произведены в условиях стандартной клинической лаборатории .

Определение экспрессии TLR . Экспрессию TLR на поверхности клеток чаще всего определяют с помощью метода иммунофлуоресценции. Принцип этого метода заключается в том, что в нем используются меченные флуоресцентными красителями моноклональные антитела (МКАТ) против CD — маркеров данного типа клеток одновременно с меченными другим флуорохромом МКАТ к изучаемому TLR (метод «двойной метки»). В качестве примера приведем краткое описание метода определения TLR2 и TLR4 на моноцитах при изучении взвеси мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови, приведенных в работе .

Для определения экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови выделенные на градиенте фиколл-урографина мононуклеарные клетки ин­кубировали с FITC-меченными антителами к СD14 + , РЕ-меченными антителами к TLR2 и TLR4 с соответствующими изотипическими контролями в течение 30 мин при 4 0 С. Анализ экспрессии CD 14 + , TLR2 и TLR4 проводили на проточ­ном цитофлуориметре. Оценивали процент моноцитов (CD 14 + -клеток), несущих на своей поверхности TLR2 и TLR4, и среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ), величину которой выражали в условных единицах (усл. ед.) флуоресценции.

Проточная лазерная цитометрия. Подготовку проб для проточной цитометрии обычно проводят следующим образом: ядросодержащие клетки периферической крови выделяют путем осаждения эритроцитов 3% раствором желатина. Перед внесением антител клеточную сус­пензию для исследования экспрессии внутриклеточных TLR предварительно обрабатывают фиксирующим пермеабилизирующим раствором. Изучение экспрессии поверхностных TLR не требует обработки этим раствором, поскольку TLR1, 2, 4, 6 и 10 являются преимущественно мембраноассоциированными. Обработка вторичными анти-мышиными антителами, меченны­ми FITS или РЕ, также должна соответствовать общепринятым стан­дартам. В качестве изотипического контроля цитометрических замеров используют IgG-фракцию от неимунизированных мышей. Конечная концентрация для анализа составляет 2х10 6 клеток/мл. Проточную лазерную цитометрию проводят на приборе с аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Цитограммы исследуемой кле­точной взвеси выводят на основе регистрируемых параметров малоуглового светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SSC) в режиме dot-plot. Анализ интенсивности флуоресцен­ции и процента флуоресцирующих клеток проводят в зеленой области (FITS) FL1 (530 нм) и оранжевой области (РЕ) FL2 (585 нм). Клетки анализируют в лучах аргонового лазера при скорости потока 5000 клеток/с. Среднюю интенсивность флуо­ресценции клеток выражают в условных единицах флуоресцен­ции (УЕФ) .

Уровень экспрессии мРНК генов TLR обычно определяют методом ПЦР в режиме «реального времени» (РВ), совмещенной с обратной транскрипцией с ис­пользованием специфических праймеров. Например, экспрессия генов TLR2 и TLR4 может быть осуществлена с помощью следующих праймеров: к TLR-2 – TLR2-F1-CCTТCACTCАGGAGСAGCААGC, TLR2-R1 – TGGAAACG-GTGGCACAGGAC; к TLR-4 – TLR4TF6 – GAAGGGGT-GCCТCCATTTCAGC, TLR4-R6 – GCCTGAGCAGGGTCT-ТСТССА. Уровни экспрессии мРНК TLR контролируют (стандартизируют) по гену GАPTAH (GAPDH-F1 - TGC-MTCCTGCACCACCAACT; GAPDH-F2 – YGCCTGCTTCAC- САССТТС) за счет сходной экспрессии этого гена в тканях человеческого репродуктивного тракта .

В настоящее время с помощью данных методов были проведены десятки исследований в области изучения Толл-подобных рецепторов при различных заболеваниях человека. Примером может служить работа «Экспрессия Толл-подобных рецепторов в носовых полипах и на клетках периферической крови у больных полипозным риносинуситом», в которой проведён сравнительный анализ экспрессии рецепторов TLR и NОD-2 в ткани но­совых полипов и на клетках периферической крови и оценена роль этих показателей в патогенезе полипозного риносинусита .

Исследователями показано, что в результате исследования из всех изученных TLR и NОD-рецепторов наибольшее патогенетическое значение имеет достоверное усиление экспрессии рецепторов TLR4 и TLR5 на гранулоцитах, моноцитах и лимфоцитах периферической крови и на клетках вос­палительного инфильтрата в носовых полипах, а также достоверное угнетение экспрессии TLR7 на этих же клетках. Известно, что активация врожденного иммунитета, усиление экспрессии TLR влечет за собой множество патофизиологических послед­ствий . В отношении иммунопатогенеза полипозного риносинусита, где бактериальная и грибковая инфекция играет роль триггера иммунного воспаления in situ, наиболее значимые по­следствия заключаются в гиперпродукции провоспалительных цитокинов и хемокинов, что является главным фактором формирования клеточного воспалительного инфильт­рата. Характерна также интенсификация фагоцитарной и антигенпрезентирующей функции клеток макрофагально-моноцитарного ряда, сопровождающаяся гиперпродукцией медиаторов воспаления. Как следствие, развивается и активация системы адаптивного им­мунитета, обеспечивающей развертывание антигенспецифического лимфоцитарного иммунного ответа in situ .

В работе авторами разработан подход к оценке компонентов системы TLR у здоровых людей, у пациентов с иммунопатологией (общей вариабельной иммунологической недостаточностью – ОВИН) и при острых патологических процессах неинфекционного генеза на примере острого инфаркта миокарда – ОИМ .

Функцио­нальную активность TLR оценивали по выработке ФНО-α моноцитами периферической крови человека в от­вет на лиганды TLR. ФНО-α – один из основных эффекторных цитокинов, обеспечивающих разви­тие воспалительной реакции. В предложенном методе авторы использовали мононуклеарные клетки, а не цельную кровь, так как растворимые ингибиторы TLR, цитокины, предсуществующие в плазме, могут негативно вли­ять на оценку функций TLR.

В результате исследований было показано, что мононуклерные клетки больных ОВИН характеризуются низким приростом уровня ФНО-α в ответ на лиганды TLR2, 6, 4 и 5 in vitro. Это может приводить к ослаблению защитных функций организма у этих больных при повторном инфицировании in vivo. При развитии острых патологических состоя­ний, таких как ОИМ, важную роль играют клетки врожденного иммунитета – нейтрофилы, макро­фаги, а также провоспалительные цитокины. Их экспрессия может быть индуцирована при актива­ции клеток через рецепторы врожденного иммунитета. При изу­чении спонтанной и индуцированной лигандами TLR выработки ФНО-α мононуклеарными клетками больных ОИМ, авторами было показано, что прогностическим признаком неблагоприят­ного исхода заболевания может слу­жить дополнительное увеличение выработки ФНО-α мононуклеарными клетками больных в ответ на лиган­ды TLR ЛПС и зимозан к 14-м суткам после раз­вития ОИМ в сравнении с индуцированной выра­боткой ФНО-α в 1-е сутки заболевания .

В работе изучалась взаимосвязь уровней мРНК TLR2 и TLR4 с изменениями иммуноглобулинового профиля урогенитального тракта при урогенитальном хламидиозе у женщин.

Авторами была установлена взаимосвязь иммуноглобулинового профиля и экспрессии мРНК рецепторов врожденного иммунитета клеток цервикального канала (ЦК) в патогенезе урогенитального хламидиоза (УГХ). Показано, что уровень IgG, IgM, IgA, slgA, а также экспрессия рецепторов TLR2 и TLR4 опреде­ляют и характеризуют течение инфекционного процесса, выраженность клинических проявлений и исход заболевания.

Повы­шение уровня экспрессии TLR2 и TLR4 в сочетании с повышением локального синтеза slgA мо­жет способствовать развитию преимущественно локального воспаления и благоприятному исходу заболевания. Как считают исследователи, данные показатели могут использоваться в ка­честве дополнительных критериев в оценке формы хламидийного процесса и остроты его протекания.

В работе изучалась роль Толл-подобных рецепторов в разви­тии иммунного воспаления в коже у больных псориасом. Изучение количе­ства и распределения толл-подобных рецепторов TLR2, TLR4 и TLR9 в структурах кожи про­водилось иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител. Авторами установлена по­вышенная экспрессия TLR2 и TLR4 на клетках эпидермиса и на эндотелиальных клетках сосудов больных псориасом, при отсутствии экспрессии TLR9. По мнению авторов, это способствует развитию хронических воспалительных реакций.

В работе изучалась ассоциация полиморфизма в генах TLR2 и TLR9 с преждевременными родами инфекционного генеза и внутриутробным инфицированием. Полиморфные маркеры в гене TLR2 были определены в клиническом материале с помощью ПЦР, полиморфный маркер в гене TLR9 был определен с помощью ПЦР в режиме реального времени. Показано, что аллель Arg полиморфного маркера Arg753Gln гена TLR2 был ассоциирован с внутриутробной инфекцией. Другой аллель А полиморфного маркера A2848G гена TLR9 ассоциирован со срочными родами при урогенитальной инфекции.

В работе с уммированы материалы о роли Toll-подобных рецепторов (TLR) и их лигандов в патогенезе атеросклероза. Бактериальные липополисахариды (ЛПС), могут взаимодействуя с TLR4, могут индуцировать формирование атеросклеротических повреждений в артериальной стенке. Риск развития атеросклероза снижается при мутационном повреждении TLR4. Другие микробные лиганды и белки теплового шока также могут принимать участие в индукции атеросклероза. Предложена единая теория атерогенеза, согласно которой индукция и прогрессирование атерогенеза является побочным эффектом взаимодействия экзогенных и эндогенных лигандов с TLR .

В работе изучалась TLR-опосредованная функциональная активность мононуклеарных клеток периферической крови детей с различными формами нейтропении. Авторами установлено, что лиганды TLR2, TLR4, TLR5 обладали повышенной стимулирующей активностью на продукцию ФНОα МНК детей с врожденной нейтропенией и не влияли на МНК детей с иммунной нейтропенией. У детей с иммунной формой нейтропении выявили значительное повышение стимулированной выработки ИФНα в ответ на лиганды TLR3, TLR8 и TLR9. Авторы считают, что выявленные изменения TLR-опосредованной функциональной активности МНК у детей с различными формами нейтропении могут иметь существенное значение в развитии и течении инфекций у этих больных.

В работе определялась экспрессия TLR в селезенке и лимфатических узлах мышей при мукозальных методах иммунизации. Иммунизацию мышей поликомпонентной вакциной Иммуновак проводили мукозально и подкожно. На основе полученных данных авторы полагают, что различная степень сенсибилизации при разных путях введения одних и тех же препаратов предопределена уже на этапе взаимодействия лиганда с TLR.

В работе изучалось значение экспрессии TLR для выбора фармакологической коррекции патологии шейки матки и эндометрия. После лечения нуклеосперматом натрия было зарегистрировано повышение частоты клеток, экспрессирующих TLR4 и TLR9 типов в исследуемом материале, а также снижение количества вируса папилломы человека высокого онкогенного риска.

В работе изучалось влияние ингибитора циклооксигеназы – лорноксикама на опосредованную TLR выработку провоспалительных и противовоспалительных цитокинов мононуклеарами периферической крови здоровых доноров и больных с острым панкреатитом. Показано, что лорноксикам ингибирует TLR-опосредованную выработку как провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, 6, 8, 12, ФНОα), так и противовоспалительного цитокина ИЛ-10 этими клетками. Применение лорноксикама у больных с острым панкреатитом на начальном этапе заболевания приводило к снижению выработки ФНОα мононуклеарами периферической крови в ответ на ЛПС и, следовательно, к снижению эффекторных функций TLR4 и TLR1/2 у этих больных, что уменьшает риск развития осложнений.

Определение экспрессии TLR и их функцио­нальной активности является начальным этапом в оценке системы TLR у человека. Для получения полной информации о функционировании систе­мы TLR необходима комплексная оценка всех ее звеньев. Подобный подход был сформулирован ра­нее для оценки иммунного статуса по патогенети­ческому принципу: предлагалось оценивать различные этапы функционирования иммунной сис­темы . Дальнейшие этапы оценки системы TLR должны включать анализ всех остальных компо­нентов системы TLR: оценку экспрессии молекул, участвующих в трансдукции сигнала, факторов транскрипции и т. д. Это позволит уточнить и ло­кализовать молекулярные дефекты нарушений в системе врожденного иммунитета, а также оценить их роль в патогенезе широкого круга заболеваний.

Большой вклад в изучении этой проблемы могут внести экспериментальные исследования с использованием трансгенных и генно-нокаутированных мышей с различными генными дефектами для того, чтобы лучше определить влияние экспрессии и полиморфизма TLR на предрасположенность к различным, в том числе инфекционным заболеваниям. Представляет также определенный интерес изучение индивидуальных путей, в которых используются специфические адаптерные белки для каждого TLR, так как это должно расширить наши представления о реакциях организма на различные лиганды TLR .

Литература

1. Симбирцев А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета. Иммунология 2005; 26 (6) : 368-376.
2. Werling D., Jungi T.W. TLR liking innate and adaptive immune response. Vet. Immunol. Immunopathol. 2003; 91 : 1-12
3. Rakoff-Nahoum S., Paglino J., Eslami-Varzaneh F. et al. Recognition of commensal microflora by TLRs is required for intestinal homeostasis. Cell 2004; 118 : 229-241.
4. Zarember K., Godowski P. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leucocytes in response to microbes, their products, and cytokines. J.Immunology 2002; 168 :554-561.
5. Harter L., Mica L., Stocker R. et al. Shock, 2004, 5 : 403-409.
6. Li Liwu Curr. Drug Targets-inflamm. Allergy, 2004, 3 : 81-86.
7. Vandenbulcke L., Bachert C., Cauwenberge P.V. et al. Int. Arch. Allergy Immunol., 2006, 139 : 159-165.
8. Picard C., Puel A., Bonnet M. et al. Science, 2003, 299 : 2076-2079.
9. Л.В.Ковальчук, М.В.Хореева и др. Рецепторы врожденного иммунитета: подходы к количественной и функциональной оценке TLR человека. Иммунопатология и клиническая иммунология 2008, 223-227.
10. М.З.Саидов, Х.Ш.Давудов и др. Экспрессия TLR в носовых полипах и на клетках периферической крови у больных полипозным риносинуситом. Иммунология, 2008, 5 : 272-278.
11. В.А.Алешкин, А.В.Караулов и др. Связь уровней мРНК TLR2 и TLR4 с изменениями иммуноглобулинового профиля урогенитального тракта при урогенитальном хламидиозе у женщин.
12. Хаитов Р.М., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Биология рецепторов врожденной иммунной системы. Физиол. и патол. Иммунной системы, 2008, 6: 3-28.
13. Pitzurra L., Bellocchio S., Nocentini A. et al. Antifungal immune reactivity in nasal polyposis. Infect. And Immun., 2004, 12 : 7275-7281.
14. Wang J., Matsukura S., Watanabe S. et al. Involvement of TLRs in the immune response of nasal polyp epithelial cells. Clin. Immunol., 2007, 3 : 345-352.
15. Huvenne W., van Bruaene N., Zhang N. et al. Chronic rhinosinusutis with and without nasal polyps: what is the difference? Curr. Allergy Asthma Rep., 2009, 3: 213-220.
16. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Пащенков М.В. Значение функциональной активности Толл-подобных рецепторов и других рецепторов врожденной иммунной системы в физиологии почек. Российский физиологический журнал, 2007, 5: 505-520.
17. Мedzhitov R. Recognition of microorganisms and activation of immune response. Nature, 2007, 18: 819-826.
18. Uematsu S., Akira S. TLRs and innate immunity. J. Mol. Med. 2006, 84: 712-725.
19. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Актуальные проблемы оценки иммунной системы человека. Иммунология, 1990, 3 : 4-7.
20. Катунин О.Р., Резайкина А.В., Колыханова О.И. «Роль распознающих рецепторов в инициации иммунного воспаления в коже больных псориазом». Вестник дерматологии и венерологии, 2010, 5 : 84-91.
21. Ганковская О.А. «Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов TLR2 и TLR9 с преждевременными родами и внутриутробным инфицированием». Медицинская иммунология, 2010, 1-2: 87-94.
22. Глинцбург А.Л., Лиходед В.Г., Бондаренко В.М. «Экзогенные и эндогенные факторы в патогенезе атеросклероза. Рецепторная теория атеросклероза». Российский кардиологический журнал 2010, 2 : 92-96.
23. Мамедова Е.А., Ковальчук Л.В., Финогенева Н.А., Половцева Т.В., Грачева Л.А., Голдырева Н.Г., Хорева М.В., Фетисова Л.Я., Никонов А.С. Опосредованная TLR функциональная активность мононуклеарных клеток у детей с нейтропениями. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 2010, 2 : 64-68
24. Ахматова Н.К., Егорова Н.Б., Ахматов Э.А., Курбатова Е.А., Семенова И.Б., Чертов И.В., Семенов Б.Ф., Зверев В.В. Экспрессия TLR в селезенке и лимфатических узлах при мукозальных методах иммунизации. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 2010, 1 : 50-54.
25. Прошин С.Н., Глушаков Р.И., Шабанов П.Д, Сайковская Л.А., Семенова И.В., Тапильская Н.И. Значение экспрессии TLR для выбора фармакологической коррекции патологии шейки матки и эндометрия. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2011, 6(1): 91-97.
26. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Никонова А.С., Греченко В.В., Агапов М.А., Индраков В.А., Леоненко И.В., Горский В.А., Грачева Л.А. Корригирующее действие ингибитора циклооксигеназы на функциональное состояние мононуклеарных клеток, экспрессирующих TLR. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 2010,1 :45-50.

Кейбір аурулар кезінде Толл-тәрізді рецепторлардың экспрессиясын зерттеу

За последние неполные десять лет в области фундаментальной иммунологии, в частности в исследованиях механизмов врожденного неспецифического иммунитета, были сделаны два выдающихся открытия, которые сейчас по праву рассматриваются в качестве основы врожденной резистентности к инфекционным заболеваниям. Во-первых, было установлено (B. Lemaitre et al., 1996), что белок Toll у дрозофилы, известный ранее как необходимый инструмент в эмбриогенезе мушки, играет важную роль в неспецифической резистентности, в частности защищает ее от инфекции, вызванной грибами рода Aspergillus. В результате по-следующих исследований белки с подобной функцией были обнаружены у млекопитающих, в том числе у человека, и получили название Toll-like (Toll-подобные) рецепторы (TLR). Во-вторых, был описан (A. Poltorak et al., 1998) один из первых таких рецепторов у мышей – TLR4, который авторы идентифицировали как рецептор для липополисахарида (LPS), необходимый мышам для эффективного распознавания и иммунного ответа на грамотрицательные бактерии, у которых LPS является неотъемлемой частью наружной клеточной мембраны. Эти исследования подтвердили наличие распознающего аппарата у клеток врожденного неспецифического иммунитета и указали на центральную роль TLR в первичном распознавании инфекционных патогенов у млекопитающих.

Открытие TLR по своей значимости сравнивают с более ранними открытиями распознающих рецепторов у В- и Т-лимфоцитов. Но, учитывая тот факт, что механизмы врожденного неспецифического иммунитета предшествуют включению механизмов специфического приобретенного иммунитета, полагают, что TLR представляют собой более важные рецепторы в иерархии общей иммунной резистентности.

В настоящее время доказано, что TLR представляют собой семейство мембранных гликопротеинов присутствующих прежде всего на дендритных клетках, макрофагах и полиморфноядерных гранулоцитах. TLR входят в суперсемейство интегральных мембранных гликопротеинов І типа, куда включены также рецепторы к интерлейкину-1 (IL-1R). При сравнении этих двух рецепторов оказалось, что внеклеточные части их существенно различаются: у IL-1R – это три Ig-подобных домена, а у TLR – лейцинобогащенные аминокислотные последовательности. Напротив, цитоплазматический домен TLR имеет высокую гомологию с таковым IL-1R и был назван TIR (Toll-IL-1-рецептор) (J.L. Slack et al., 2000). В общей сложности цитоплазматический домен состоит из приблизительно 200 аминокислот, гомологичные участки которых составляют три отдельных региона (box), необходимые для сигнальной трансдукции, т.е. для передачи сигнала внутрь клетки.

TLR клеток моноцитарно-макрофагального ряда и, прежде всего, дендритных клеток, связываются со своими лигандами и передают сигнал тревоги внутрь клетки, что приводит к включению продукции целого ряда провоспалительных цитокинов и ко-стимуляционных молекул. В итоге развивается воспаление как защитная реакция организма со стороны неспецифического иммунитета и делаются первые шаги по развитию специфического (адаптивного) иммунитета (Sh. Akira, K. Takeda, 2004; B. Beulter, 2004).

УДК 571.27; 578.224

^лл-подобные рецепторы (TLR) и их значение в опухолевой прогрессии

Д. В. Щебляков, Д. Ю. Логунов*, А. И. Тухватулин, М. М. Шмаров, Б. С. Народицкий,

А. Л.Гинцбург

ФБГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития РФ, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 28.08.2010 г.

РЕФЕРАТ Толл-подобные рецепторы (TLR) являются главными компонентами системы врожденного иммунитета, которые опосредуют специфическое распознавание эволюционно консервативных молекулярных структур патогенов (PAMP - pathogen associated molecular patterns). Толл-подобные рецепторы представлены на клетках разного типа - от эпителиальных до иммунокомпетентных. Как известно, при связывании TLR с собственными лигандами происходит активация ряда адаптерных белков и киназ, которые участвуют в индукции ключевых провоспалительных факторов. Итогом такой индукции является развитие как врожденного иммунного ответа в результате усиления экспрессии ряда антиапоптотических белков, провоспалительных цитокинов, антибактериальных белков, так и приобретенного иммунного ответа через созревание дендритных клеток, презентации антигена и т.д. Благодаря своей способности усиливать специфические и неспецифические иммунные реакции организма агонисты Толл-подобных рецепторов нашли применение не только в терапии инфекционных заболеваний, но также в качестве адъювантов в химиотерапии различных злокачественных новообразований. Однако к настоящему моменту описаны принципиально различные эффекты TLR на опухоли. С одной стороны, показано, что TLR (и их лиганды) могут выступать в роли супрессоров опухолевого роста, с другой стороны, TLR могут стимулировать опухолевую прогрессию и влиять на устойчивость опухолей к химиотерапии. В представленном обзоре обобщены данные о влиянии TLR и их агонистов на рост опухоли, а также проанализированы основные механизмы, лежащие в основе таких различий.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА Толл-подобные рецепторы, агонисты рецепторов врожденного иммунитета, опухоль, врожденный иммунный ответ, воспаление.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ TLR - Толл-подобные рецепторы; ЛПС - липополисахарид; NF-kB - ядерный фактор транскрипции kB; PRR - паттерн-распознающие рецепторы; PAMP - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны; DAMP - молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждением; IRF -интерферонрегулирующий фактор, оц- и дцРНК - одно- и двухцепочечная рибонуклеиновая кислота; TNF-a - фактор некроза опухоли a; IL - интерлейкин; IFN - интерферон; NK-клетки - естественные киллеры; миРНК - малые интерферирующие РНК; TGF - трансформирующий фактор роста.

ВВЕДЕНИЕ ческим фактором, активирующим экспрессию генов

По современным представлениям воспаление явля- ряда антиапоптотических белков, таких, как IAP,

ется одной из главных причин возникновения и про- Bcl-2, Bcl-XL и др. Присутствие этих белков увели-

грессии опухолевых заболеваний . Механизм чивает устойчивость клеток к различным стрессовым

этой взаимосвязи изучен недостаточно полно, но уже воздействиям, возникающим в ходе развития вос-

сегодня понятен ряд ключевых событий, происходя- паления .

щих в очаге воспаления и необходимых для возник- 2) Процесс воспаления сопровождается индукцией

новения и прогрессии опухоли. окислительного стресса - причине появления и на-

1) В клетках, находящихся в очаге воспаления, копления мутаций, а также генетических перестроек поддерживается стабильно высокая активность в клетках .

транскрипционного фактора NF-kB , ответствен- 3) На завершающих этапах воспаления секретиру-

ного за экспрессию провоспалительных цитокинов, ется большое количество провоспалительных цитомногие из которых (GROa,P,y, IL-8, MIP-3a) обла- кинов (GROa/CXCL1, GROP/CXCL2, GROy/CXCL3

дают опухолестимулирующим действием . Бо- и IL-8/CXCL8, MIP-3a, IL-1) и факторов роста

лее того, NF-kB считается основным антиапоптоти- (TGF-^1, PDGF, bFGF, TGF-a, IGF-I, IGF-II), ко-

торые усиливают миграцию в очаг воспаления клеток стромы (фибробластов) и эпителиальных клеток, а также их последующую пролиферацию . При хроническом воспалении процессы репарации и альтерации зачастую происходят одновременно, что заставляет клетки пролиферировать в условиях гипоксии и генотоксического стресса, повышая тем самым риск возникновения мутаций.

Наиболее частой и хорошо изученной причиной развития воспаления является микробная инвазия, в ходе которой патоген способен различными способами нарушать гомеостаз клетки хозяина.

Один из таких механизмов - взаимодействие высококонсервативных участков молекул патогена с эукариотической клеткой через паттерн-распознающие рецепторы (PRR - RIG-I-подобные рецепторы, Nod-подобные рецепторы, лектины C-типа, Толл-подобные рецепторы (TLR) и др.), расположенные на поверхности и/или внутри эукариотических клеток .

Связывая различные бактериальные лиганды, PRR играют ключевую роль в развитии воспаления, инициируя развитие как врожденного иммунного ответа (усиливают экспрессию ряда антиапоп-тотических белков, провоспалительных цитокинов, антибактериальных белков), так и приобретенного (индуцируют созревание дендритных клеток, презентацию захваченного антигена, дифференцировку наивных Т-хелперов) .

В связи с этим становится актуальным изучение роли PRR в индукции опухолеобразования и стимуляции опухолевой прогрессии при развитии бактериальной инфекции.

В данном обзоре мы остановим внимание на роли TLR в развитии воспалительных реакций и попытаемся оценить их взаимосвязь с опухолевой прогрессией.

Сегодня накоплены данные, свидетельствующие о том, что TLR ассоциированы с опухолевым ростом. Однако к настоящему моменту опубликованы противоречивые данные, подтверждающие как опухолестимулирующее , так и опухоле-супрессирующее действие TLR .

В связи с этим целью нашего обзора является систематизация имеющихся данных и описание возможных механизмов, обусловливающих различия в проявляемых эффектах TLR на рост опухоли.

функция KR

TLR по выполняемым в организме функциям относят к семейству PRR, которые опосредуют специфическое распознавание эволюционно консервативных структур патогенов (PAMP - pathogen associated molecular patterns). Связываясь с РАМР, TLR активируют систему врожденного иммунитета и во многом определяют развитие адаптивного иммунитета . Наиболее консервативная роль TLR - активация антимикробного иммунитета в коже, слизистых оболочках респираторного, гастроинтестинального и урогенитального тракта.

TLR распознают микробные молекулы, что приводит к развитию воспалительных реакций, вызванных активацией фактора NF-kB, который регулирует экспрессию провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-1, IL-6 и др.) и хемокинов (MCP-1, MCP-3, GM-CSF и др.).

TLR вовлечены в транскрипционную и посттран-сляционную регуляцию (протеолитическое расщепление и секрецию) таких антимикробных факторов, как дефензины (а и в), фосфолипаза А2, лизоцим и др. . TLR усиливают поглощение микроорганизмов фагоцитами и оптимизируют их инактивацию, регулируя выброс перекисных радикалов и оксида азота .

Известно, что TLR, находящиеся на поверхности эндотелиальных клеток, опосредованно обеспечивают миграцию лейкоцитов в очаг воспаления, стимулируя экспрессию молекул адгезии лейкоцитов -Е-селектина и ICAM-1 .

Стимуляция TLR прямо ведет к увеличению продукции интерферонов (IFN)-a/p как стромальными, так и гемопоэтическими клетками, что важно для защиты организма от вирусных и некоторых бактериальных инфекций . Более того, недавно было установлено, что TLR, активируя ряд молекул (FADD, каспаза 8, протеинкиназа R (PKR)) или стимулируя экспрессию IFN-а/в, могут индуцировать развитие апоптоза - важного механизма, защищающего клетки от патогенных микроорганизмов .

Показано, что TLR играют центральную роль в регуляции адаптивного иммунного ответа. Так, TLR-зависимая активация профессиональных анти-генпредставляющих дендритных клеток является определяющим моментом в нескольких принципиальных для развития адаптивного иммунитета процессах: активации зрелых T-клеток; процессинга и презентации микробных антигенов; повышении экспрессии костимуляторных молекул (CD80, CD86), необходимых для активации наивных CD4 + -T-клеток; подавлении регуляторных T-клеток посредством продукции IL-6 . Также известно, что TLR-зависимая активация важна для пролиферации и созревания В-клеток во время инфекции .

Таким образом, TLR выполняют в организме важную роль, которая заключается в развитии воспалительных реакций (активации врожденного иммунитета) в ответ на попадание в организм самых различных патогенов (простейших, грибов, бактерий, вирусов). Более того, по современным представлениям распознавание патогенов посредством TLR является ключевым моментом в формировании второй

линии защиты - адаптивного иммунитета . Также показано, что TLR принимают участие в нормальном функционировании кишечника, они вовлечены в развитие аутоиммунных заболеваний (системная волчанка), артритов, атеросклероза и др. . В последнее время получены данные, которые показывают, что TLR способны активировать противоопухолевый иммунитет или, наоборот, стимулировать опухолевую прогрессию .

СТРУКТУРА TLR, ИХ ЭКСПРЕССИЯ РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ КЛЕТОК, СПЕЦИФИЧНОСТЬ ПО ОТНОШЕНИЮ К РАЗЛИЧНЫМ МОЛЕКУЛЯРНЫМ СТРУКТУРАМ (PAMP И DAMP)

По своей структурной организации TLR относятся к семейству рецепторов IL-1 (IL-1R). TLR - это трансмембранные белки, которые экспрессируются на поверхности клетки и в субклеточных ком-партментах (таких, как эндосомы). Локализация TLR связана с типом распознаваемого им лиганда. Так, TLR 1, 2, 4, 5, 6, связывающие структурные бактериальные компоненты, локализуются на поверхности клеток, тогда как TLR 3, 7, 8, 9, распознающие преимущественно вирус-ассоциированные структуры - нуклеиновые кислоты (дцРНК, оцРНК, ДНК), находятся в эндосомах, где взаимодействуют с лигандами после депротеинизации ви-рионов .

В структуре TLR выделяют N-концевой лейцин-богатый (LRR) домен, ответственный за связывание лигандов, трансмембранный домен и С-концевой внутриклеточный сигнальный домен (гомологичный внутриклеточному домену IL-1R) .

TLR экспрессируются в большинстве типов клеток организма человека, включая негемопоэтиче-ские эпителиальные и эндотелиальные клетки. Количество одновременно экспрессируемых TLR и их сочетание специфичны для каждого типа клеток,

а больше всего TLR в клетках гемопоэтического происхождения, таких, как макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки (табл. 1) .

В настоящий момент у млекопитающих идентифицировано 13 различных TLR, у человека - 10 и 12 у мышей. TLR с 1-го по 9-й консервативны у человека и мыши. Однако существуют и различия. Ген, кодирующий TLR10, обнаружен только у человека, а TLR11 - у обоих видов, но функционален только у мышей .

Главная особенность TLR, отличающая их от рецепторов приобретенного иммунитета (T- и В-клеточные рецепторы), состоит в их способности распознавать не уникальные эпитопы, а эволюционно консервативные патоген-ассоциированные молекулярные структуры (PAMP), широко представленные у всех классов микроорганизмов и вирусов независимо от их патогенности.

Специфичность распознавания PAMP достаточно хорошо изучена у большинства TLR, сегодня известны лиганды TLR 1-9 и 11 (рис. 1). Биологическая роль и специфичность TLR10 (человек), 12 и 13 (мышь) остаются неизвестными .

Наиболее известные микробные лиганды TLR:

Бактериальные липопептиды, липотейхоевая кислота и пептидогликаны; липоарабидоманнан микобактерий; компонент клеточной стенки грибов зи-мозан, которые связываются с TLR2, образующим гетеродимеры с TLR1, TLR6 и CD14;

ЛПС грамотрицательных бактерий, лиганд TLR4;

Компонент жгутиков бактерий - флагеллин, активирующий TLR5;

Профиллин-подобные структуры простейших, связывающиеся с TLR11;

ДНК (неметилированные CpG-последовательности), распознаваемая TLR9;

ДцРНК - лиганд TLR3;

ОцРНК - лиганды TLR7 и TLR8.

Рис. 1. Толл-подобные рецепторы и их лиганды.

Бактериальные компоненты

Липопротеины Липоарабидоманнан Липотейхоевые кислоты Зимозан (дрожжи)

T. gondi ЛПС Флаггелин Профиллин

TLR4 =TLR5 =TLR11

Вирусные компоненты

Неметили-

рованная

CpG ДНК дцРНК оцРНК

ÜTLR9 =TLR3 =TLR7

Недавно было показано, что TLR могут активироваться многими эндогенными молекулами - ал-ларминами (гиалуроновая кислота, белки теплового шока и др.), которые появляются при разрушении тканей. Эти гетерогенные по своей природе и структуре соединения (PAMP и аллармины), распознаваемые TLR, в настоящее время объединяют в одно семейство, именуемое DAMP (damage associated molecular patterns) .

КАСКАД СИГНАЛОВ, АКТИВИРУЮЩИЙСЯ ПОСЛЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ TLR С СОБСТВЕННЫМИ ЛИГАНДАМИ

Теперь от описания структуры и функций TLR перейдем к событиям, разворачивающимся после их связывания с собственными лигандами.

Связывание лиганда с TLR инициирует каскад сигналов, берущих начало от цитоплазматических TIR-доменов TLR. Сигнал от TIR-домена через адап-терные молекулы MyD88 (myeloid differentiation factor 88), TIRAP (TIR-доменсодержащие адаптеры), TICAM1 (TRIF), TICAM2 (TIR-containing adaptеr molecule) передается на соответствующие киназы (TAK, IKK, TBK, MAPK, JNKs, p38, ERK, Akt и др.), которые дифференциально активируют факторы транскрипции (NF-kB, AP-1 и IRF), ответственные за экспрессию различных провоспалительных и антимикробных факторов. При этом все TLR, кроме TLR3, передают сигнал на киназы, используя MyD88. TLR3 передает сигнал через TICAM1, a TLR4 и через MyD88, и через TICAM1 (рис. 2).

Активация того или иного фактора определяется типом TLR, от которого передается сигнал. Так, практически все TLR (TLR2 и его корецепторы -TLR1 и TLR6, а также TLR4-9, TLR11), связываясь с собственными лигандами, способны активировать NF-kB - один из основных факторов, регулирующих экспрессию таких провоспалительных цито-кинов, как IL-1, -6, -8 и др. К активации другого семейства провоспалительных транскрипционных факторов - IRF приводит передача сигнала через TLR3, 4, 7-9. Сигналы, передаваемые через TLR3 или TLR4, ведут к активации IRF3, который регулирует экспрессию IFN-ß и считается критическим компонентом противовирусных иммунных реакций. Передача сигналов посредством TLR7-9 ведет к активации IRF5 и IRF7 и экспрессии IFN-a, который также играет жизненно важную роль в противовирусной защите. Сигнализация через TLR2 или TLR5 не ведет к активации факторов семейства IRF .

Таким образом, взаимодействие TLR определенного типа с собственным лигандом инициирует запуск сигнального каскада, который приводит к активации

Таблица 1. Активация транскрипционных факторов NF-kB и IRF различными ^R

^п TLR Активация NF-kB Активация IRF

TLR7 + + (IRF5, 7)

TLR8 + +(IRF5, 7)

TLR9 + +(IRF5, 7)

экспрессии специфического сочетания генов (цито-кинов, антимикробных молекул и т.д.).

Однако в настоящее время многое в активации TLR-зависимых сигнальных путей и в развитии последующих эффектов остается непонятным. В доступной научной литературе отсутствуют данные, характеризующие полные транскриптомные и про-теомные изменения, которые происходят в ответ на активацию определенных TLR.

TLR И ОПУХОЛИ

К настоящему моменту описаны принципиально различные эффекты TLR на опухоли. С одной стороны, показано, что TLR (и их лиганды) могут выступать в роли супрессоров опухолевого роста, с другой, известно, что TLR могут стимулировать опухолевую прогрессию и влиять на устойчивость опухолей к химиотерапии. Чтобы объяснить эти противоречия, рассмотрим детально каждый из случаев.

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ TLR

Многие агонисты TLR в настоящее время проходят клинические испытания в качестве противоопухолевых средств (табл. 2). Так, природные (оцРНК) и синтетические (имиквимод) агонисты TLR7 и 8 показали высокую активность в отношении хронического лимфоцитарного лейкоза и опухолей кожи . Лиганд TLR9 - cpG, способен подавлять рост лимфом, опухолей головного мозга, почек, кожи . А лиганд TLR3 - poly(IC) обладает проапоптотическим действием не только в отношении опухолевых клеток, но и клеток окружения (например, эндотелия) .

Показано, что агонисты TLR4 - ЛПС грамотрица-тельных бактерий и ОК-432 (препарат из стрептококков группы А), обладают высокой противоопухолевой активностью при внутриопухолевом введении. Однако при системном введении оба препарата (ЛПС и ОК-432) не обладали способностью блокировать опухолевый рост . В настоящее время препарат ОК-432 проходит вторую стадию клинических испытаний, в качестве средства против колоректальных опухолей

Рис. 2. Сигнальные пути, идущие от Толл-подобных рецепторов.

Плазматическая мембрана

Эндосома

Внеклеточный домен

Трансмембранный домен

липопептид

и рака легкого. Также показано, что ОМ-174, химический агонист ^И2/4, способен подавлять прогрессию меланомы и повышать выживаемость экспериментальных животных при совместном введении с цикло-фосфамидом . В этих экспериментах обнаружено, что агонисты TLR2/4 индуцируют секрецию TNF-a и экспрессию индуцибельной ПО-синтазы. Как известно, N0 способен индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, устойчивых к химиотерапии, и тем самым повышать продолжительность жизни мышей. Еще один известный противоопухолевый препарат микробного происхождения, активирующий ^Г-зависимые реакции (TLR2, 4, 9), - БЦЖ. Этот препарат уже более 30 лет относительно успешно применяется в терапии опухолей мочевого пузыря .

Таблица 2. TLR в клинических исследованиях

В целом, необходимо отметить, что в настоящее время различные агонисты TLR проходят клинические испытания как средства против опухолей различного происхождения (табл. 2).

Один из основных механизмов противоопухолевой активности TLR состоит в их способности стимулировать развитие опухолеспецифического иммунного ответа. Так, активация ^Г:

1) стимулирует (прямо или опосредованно) миграцию в опухоль ПК-клеток, цитотоксических Т-клеток и Т-хелперов 1-го типа, которые вызывают лизис опухолевых клеток при помощи различных эффекторных механизмов (секреция перфоринов, гранзимов, №N-7 и др.) ;

2) приводит к секреции I типа (№П-а, в) .

Злокачественное образование

Немелкоклеточный рак легкого поздней стадии ^И9

Меланома IV стадии

Меланома ШЬ/с, или IV стадии

Неполностью операбельный рак поджелудочной железы ^И2/6

Рецидив неходжкинской лимфомы

Рецидив глиобластомы

Хронический лимфобластный лейкоз ^И7

Таблица 3. Влияние ^R на развитие и рост опухоли

Опухолестимулирующая активность TLR Противоопухолевая активность TLR

Стимуляция ангиогенеза 2, 9 Подавление ангиогенеза 7, 9

Стимуляция пролиферации 3, 4 Развитие апоптоза 3, 4, 7, 9

Химиорезистентность 4 Повышение химиочувствительности 2, 4, 7

Активация регуляторных Т-клеток (Treg) 4, 5 Ингибирование Treg, презентация антигена 4, 5, 7, 8, 9

Цитотоксичность 9

Еще один вероятный механизм противоопухолевой активности TLR - возможность TLR-зависимого перехода опухолестимулирующего типа макрофагов (М2) в опухолесупрессирующий тип M1. Макрофаги типа М2 характеризуются экспрессией таких цито-кинов, как TGF-ß и IL-10, компонентов, необходимых для репарации и ремоделирования тканей. TGF-ß стимулирует пролиферацию опухолевых клеток, IL-10 направляет развитие иммунного ответа в сторону Th2, блокируя тем самым развитие клеточного противоопухолевого иммунитета. Макрофаги типа М1, напротив, экспрессируют IL-1, -6, -12, TNF-a, IFN-y и стимулируют развитие противоопухолевого клеточного (Th1) иммунного ответа .

ОПУХОЛЕСТИМУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ TLR

Как известно, хронические инфекции и воспаление являются важнейшими факторами, стимулирующими развитие злокачественных новообразований. В частности, рак желудка может быть связан с хроническим воспалением, вызванным таким патогеном, как Helicobacter pylori, а хроническое воспаление пищеварительного тракта часто ассоциировано с развитием рака толстой кишки . Более того, показано, что применение нестероидных противовоспалительных препаратов может снижать риск развития некоторых типов злокачественных новообразований .

TLR служат ключевым звеном системы врожденного иммунитета человека и животных, они участвуют в развитии воспалительных реакций при контакте клеток с различными патогенами. В настоящее время активно изучается роль TLR в развитии и прогрессии опухолей различного происхождения. TLR могут быть вовлечены в процесс развития и стимуляции опухолеобразования посредством нескольких механизмов (табл. 3).

Один из важнейших факторов, обусловливающих взаимосвязь хронического воспаления и опухоле-образования - NF-kB . Этот фактор конститутивно активирован более чем в 90% опухолей человека, включая острый и хронический миелоидный лейкоз, рак предстательной железы, множественную миело-му, злокачественную гепатому (рак печени) и т.д. . В связи с этим агенты, способные активировать NF-kB, могут непосредственно участвовать в процессе развития и прогрессии опухоли. Как известно, взаимодействие патогенов с TLR на поверхности клетки приводит к активации NF-kB и экспрессии NF-kB-зависимых генов, что и обусловливает участие TLR в стимуляции канцерогенеза. Активация NF-kB приводит к повышению продукции цитоки-нов IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-a; миграции клеток иммунной системы к месту воспаления в результате повышения продукции хемокинов; «поддержанию» хронического воспаления; повышению продукции антиапоптотических факторов и т.д. Указанные свойства могут обеспечивать выживаемость и прогрессию опухоли за счет подавления апоптоза и цитотоксичности, а также индукции ангиогенеза .

В настоящее время известно, что уровень TLR повышен в клетках различных опухолей, и у мышей с нокаутом генов ТLR снижена частота образования индуцируемых опухолей . Более того, повышение экспрессии TLR на поверхности клеток опухоли предстательной железы или опухоли головы и шеи может стимулировать их пролиферацию .

Huang и соавт. показали, что Listeria monocytogenes обладает прямым опухолестимулирующим действием, связанным с ее способностью активировать TLR2-зависимые сигнальные пути в клетках рака яичника. Более того, TLR2-зависимая активация NF-kB, вызванная L. monocytogenes, приводила к повышению устойчивости опухолевых клеток к действию химиотерапевтических препаратов . Взаимосвязь TLR2 с опухолевой прогрессией подтверждена в еще одном независимом исследовании, в котором Karin и соавт. доказали ключевую роль этого рецептора в метастазировании рака легкого. Оказалось, что у мышей с нокаутом гена TLR2 ме-тастазирование и прогрессия опухолей происходит значительно медленнее, чем у мышей дикого типа. Ключевую роль в прогрессии рака легкого играли миелоидные клетки, экспрессирующие TNF-a в ответ на их стимуляцию версиканом (протеогликаном внеклеточного матрикса, лиганда TLR2, уровень которого повышен в опухолевых клетках многих ти-

пов). В наших исследованиях также изучали роль TLR2 в опухолевой прогрессии. В частности, оказалось, что микоплазменная инфекция (Mycoplasma arginini) или добавление структурных компонентов (ЛАМБ) этого возбудителя к клеткам, экспрессирующим TLR2, приводит к подавлению в них апоптоза, а также к усилению опухолевого роста в условиях in vivo . Таким образом показано, что TLR могут оказывать опосредованный опухолестимулирующий эффект через клетки миелоидного ряда .

Сходные данные получены и для другого представителя семейства TLR - TLR4. Системное (внутривенное) введение лиганда этого рецептора -ЛПС, стимулировало миграцию опухолевых клеток (аденокарцинома молочной железы) и повышало их инвазивность, а также стимулировало ангиогенез в опухолях . Аналогичные результаты получены на другой модели - аденокарциноме кишечника: ЛПС увеличивал выживаемость клеток опухоли, стимулировал их пролиферацию, а при интрапери-тонеальном введении усиливал метастазирование . Более того, Huang и соавт. показали, что опухолевые клетки, экспрессирующие TLR4, вызывают значительно более агрессивное течение заболевания (сокращение времени жизни животных) по сравнению с мышами изогенной линии, у которых TLR4 инактивирован специфической миРНК. Полученные данные позволили предположить, что на прогрессию TLR4-позитивных опухолей могут влиять эндогенные лиганды (белки теплового шока; в-дефензины; эндогенный ЛПС, забрасываемый из кишечника), что отчасти напоминает ситуацию с опухолестимулирующим действием TLR2 и его лигандом эндогенного происхождения - версиканом .

Однако данные, иллюстрирующие опухолестимулирующее действие TLR, получены не только для TLR2 и 4. Известно, что повышенная экспрессия TLR5 и TLR9 на клетках эпителия шейки матки может быть ассоциирована с прогрессией рака шейки матки . Высокий уровень экспрессии TLR9 обнаружен в клинических образцах рака легкого и в линиях опухолевых клеток. В этих клетках стимуляция TLR9 специфическими агонистами приводила к повышению продукции опухоль-ассоциированных цитокинов . На поверхности клеток опухоли предстательной железы человека также повышен уровень TLR9 . Обработка таких клеток CpG-олигодезоксинуклеотидами (ODN-CpG) или бактериальной ДНК, служащих лигандами для TLR9, способствовала повышению инвазии опухолевых клеток. Повышение инвазии опухолевых клеток в результате активации TLR9 можно рассматривать как новый механизм, посредством которого хронические инфекции могут стимулировать рост клеток опухоли предстательной железы.

Однако способностью стимулировать канцерогенез через взаимодействие с TLR обладают не только различные инфекционные агенты и их структурные компоненты. Как известно, лигандами для TLR служат также DAMP - ядерные и цитоплазматические белки клеток, подвергшихся некрозу. Высвобождаемые из поврежденных клеток DAMP могут распознаваться различными TLR на поверхности иммунных клеток, а последующая активация TLR-зависимых сигналов способна приводить к подавлению противоопухолевого иммунного ответа и, как следствие, к стимуляции прогрессии опухоли .

К таким молекулам, обладающим потенциальным опухолестимулирующим действием, относятся: белки теплового шока (HSP60, 70), АТР и мочевая кислота, семейство Са2+-модулирующих белков (S100), белок HMGB1 и нуклеиновые кислоты, из которых наиболее хорошо изучен ДНК-связывающий белок HMGB1. Высвобождаемый в результате повреждения клеток белок HMGB1 активирует иммунную систему через взаимодействие с TLR. На культурах клеток показано, что белок HMGB1 стимулирует рост клеток меланомы, рака молочной железы, толстой кишки, поджелудочной и предстательной железы. HMGB1 способен активировать TLR2 и TLR4 на опухолевых клетках и клетках иммунной системы и, как следствие, индуцировать опухолевую прогрессию и метастазирование .

Показано, что в клетках меланомы повышена экспрессия таких DAMP, как белки семейства S100, способные стимулировать рост и самих клеток меланомы, и лимфоцитов периферической крови, действуя как аутокринный фактор роста опухоли. Белок S100A4, служащий лигандом для TLR, стимулирует метастазирование клеток рака молочной железы, а его повышенная экспрессия является показателем плохого прогноза. Несмотря на взаимосвязь S100A4 с метаста-зированием, этот белок может экспрессироваться макрофагами, лимфоцитами и фибробластами. Недавние исследования показали, что белки S100A8 и S100A9, продуцируемые первичной опухолью, способны активировать сывороточный амилоид А (SAA) 3 в легочных тканях и создавать тем самым условия для образования метастатической ниши. SAA3 служит лигандом для TLR4 на эндотелиальных клетках легкого и макрофагах. Активация TLR4 облегчает миграцию опухолевых клеток из первичного очага в ткань легкого за счет формирования микроокружения, способствующего росту опухоли. Таким образом, подавление сигнального пути S100-TLR4 может эффективно противодействовать образованию метастазов в легком .

Суммируя описанные эффекты, можно сделать вывод о способности TLR, с одной стороны, прямо или опосредованно участвовать в опухолевой про-

грессии, а с другой - повышать устойчивость опухолевых клеток к проапоптотическим воздействиям.

Представленные данные показывают, что опухолестимулирующие эффекты TLR и их лигандов имеют сложный механизм, который необходимо изучать более детально. Однако, несмотря на сложность данного вопроса, можно выделить несколько ключевых моментов, определяющих опухолестимулирующее действие TLR:

1) взаимодействие TLR с собственными лигандами индуцирует активацию транскрипционного фактора NF-kB и, как следствие, повышение продукции различных провоспалительных цитокинов (^-6, МСР-1, М№, GR0a и др.), а также ряда антиапоптотических белков, тем самым способствуя прямому или опосредованному опухолестимулирующему действию;

2) TLR-зависимая активация миелоидных клеток и их предшественников, по-видимому, является определяющим фактором в формировании метастазов. В серии независимых работ показано, что мие-лоидные клетки, мигрирующие из костного мозга (в ответ на эндогенную стимуляцию) в ткани, играют ключевую роль в формировании метастатических ниш . Поскольку известно, что эндогенные (версикан, фибронектин и др.) и экзогенные (микробного происхождения) лиганды TLR способны, с одной стороны, стимулировать миелоидные клетки и их предшественники, а с другой - увеличивать метастатический потенциал опухоли, то можно с высокой вероятностью предположить существование взаимосвязи между TLR-зависимой активацией миело-идных клеток и их последующим участием в мета-стазировании;

3) активация TLR может стимулировать ангиогенез через такие ангиогенные факторы, как ^-8, фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) и матрикс-ные металлопротеиназы (ММР), а также усиливать адгезивные и инвазивные свойства опухолевых клеток наряду с увеличением проницаемости сосудов.

ТОЛЛ-ПОДОБНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ В ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ

Благодаря способности агонистов ТLR индуцировать противоопухолевый иммунный ответ путем регуляции функции клеток иммунной системы, находящихся в микроокружении опухоли, перспективной представляется противоопухолевая терапия, основанная на доставке лигандов ТLR в очаги роста опухоли. Примером такой терапии может стать препарат имиквимод, содержащий агонист TLR7. Этот препарат используется при актиническом кератозе и базальноклеточной карциноме. Изучается также возможность использования этого препарата в качестве адъюванта в терапии мелано-

мы . Еще один агонист TLR7, используемый в терапии опухолей, - препарат 852А. В настоящее время рассматривается возможность использования препарата 852А в терапии хронического лимфоидного лейкоза и других солидных опухолей . Агонист TLR9 - 0DN-CpG, индуцирует активацию и созревание дендритных клеток, стимулирует развитие Т-клеточного противоопухолевого ответа. В настоящее время проводятся клинические испытания безопасности и эффективности агонистов TLR9 в терапии рака молочной железы, толстой кишки, легкого, меланомы, глиобластомы и др. . Макрофаг-активирующий липопептид-2 (MALP-

2), агонист TLR2/6, показал обнадеживающие результаты в терапии рака поджелудочной железы: внутриопухолевое введение MALP-2 совместно с гемцитабином во время лапоротомии значительно повышало продолжительность жизни больных с неполностью операбельным раком (от 9 до 17 месяцев) . Описанные примеры эффективного использования агонистов TLR в терапии опухолей показывают перспективность использования этих препаратов, а также целесообразность дальнейших исследований, направленных на создание противоопухолевых препаратов с аналогичным механизмом действия.

Однако, как сказано ранее в этом обзоре, большое количество опухолевых клеток могут экспрессировать ТLR на своей поверхности, и прямое взаимодействие таких клеток с лигандами к TLR может усиливать прогрессию опухоли, а также делать ее менее чувствительной к химиотерапевтическим препаратам. Таким образом, существует вероятность того, что постоянно циркулирующие в организме агонисты TLR (патогенные микроорганизмы, способные преодолевать иммунный барьер; ЛПС бактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры кишечника, который может забрасываться в кровоток; собственные эндогенные лиганды) могут прямо или опосредованно способствовать усилению опухолевой прогрессии.

В связи с этим перспективное направление в терапии злокачественных новообразований состоит в использовании подходов, ориентированных на подавление TLR-зависимых сигнальных путей. В качестве уже известных подходов, применяемых в терапии злокачественных новообразований, можно выделить использование ингибиторов NF-kB.

Как известно, конститутивная активация этого фактора наблюдается в таких типах опухолей, как: болезнь Ходжкина, острый лимфобластозный лейкоз, множественная миелома, рак молочной железы, толстой кишки, легкого, яичников, предстательной железы, различные виды лимфом, рак печени, меланома и др. .

Для подавления активности NF-kB используются несколько групп лекарственных средств: нестероидные противовоспалительные средства, ингибирующие активность 1КК и СОХ-2; природные и биодоступные ингибиторы 1ККв - флавониды, про-стагландины, BMS-345541, PS1145, SС-514 и SPС839; а также ингибиторы протеасом, подавляющие активность NF-kB за счет предотвращения деградации 1кВ - бортезомиб (PS-341), иринотекан, гемцитабин и др. препараты, широко используемые в терапии опухолей толстого и тонкого кишечника, желудка, поджелудочной железы и др.

Поскольку фактор NF-kB является ключевым звеном TLR-зависимого сигнального пути, то использование его ингибиторов представляется перспективным для подавления TLR-зависимой стимуляции опухолевого роста.

Другой перспективной мишенью, по нашему мнению, могут быть сами TLR. Поскольку TLR2 и TLR4 (рецепторы, участвующие в стимуляции опухолевого роста) экспрессируются на поверхности клетки, представляется возможным использовать специфические молекулы (антитела, химические ингибиторы), подавляющие их функциональную активность. К настоящему моменту получены антитела, блокирующие активность TLR, однако данные по их клиническому использованию в доступной научной литературе отсутствуют.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ТLR входят в состав семейства PRR. Эффекты, связанные с их активацией, выходят за рамки реакций врожденного иммунного ответа. Участие в активации дендритных клеток, регуляции специфических иммунных реакций на уровне Т- и В-клеток, повышение экспрессии IFN и др. обусловливают вовлечение ТLR в формирование эффективного ответа врожденной и адаптивной иммунной системы при попадании в организм различных патогенов или при поддержании тканевого гомеостаза. Опубликованы результаты многочисленных исследований, согласно которым лиганды к TLR могут использоваться в качестве адъювантов для иммунотерапии злокачественных новообразований. Однако известно, что активация ТLR на поверхности опухолевых клеток может приводить к усилению прогрессии опухолей различного происхождения.

Такое различие в эффектах зависит, в первую очередь, от типа используемого лиганда. Как показано в табл. 1, ТLR можно разделить на две группы: индуцирующие и неиндуцирующие выработку Как правило, при введении агонистов TLR3, 4,

7, 8, 9, активирующих IRF, наблюдается подавление роста опухоли. В то же время данные о противоопу-

холевом действии агонистов TLR2, который в отличие от перечисленных рецепторов (TLR3, 4, 7, 8, 9) не способен активировать выработку IFN I типа, в настоящее время отсутствуют. Еще одна характерная особенность, обусловливающая различия в действии агонистов TLR на опухоль, - это способ их введения. Внутриопухолевое введение лигандов TLR3, 4, 7, 8, 9 в подавляющем большинстве случаев вызывает гибель клеток опухоли и уменьшение ее размеров. Наиболее вероятное объяснение противоопухолевой активности этих TLR заключается в их способности в ответ на взаимодействие с лигандом: а) индуцировать локальную экспрессию IFN типа I и II, которые, как известно, способны вызывать гибель опухолевых клеток; б) активировать клеточный иммунитет. При этом гибель опухолевых клеток, их фагоцитоз и последующая презентация опухолеспецифических антигенов обусловливают дополнительную стимуляцию специфического противоопухолевого иммунитета. Однако в ряде работ показано, что системное введение лигандов к TLR4 наоборот часто ассоциировано со стимуляцией роста опухоли. По нашему мнению, такое различие связано с тем, что вну-триопухолевые инъекции лиганда TLR4 (ЛПС) вызывают существенно большее накопление IFN непосредственно в опухолях, чем при системном введении лиганда. Поскольку IFN это короткодистантные эффекторные белки, действующие при достаточно высоких концентрациях, то их выработка вне опухоли (при системном введении) не приводит к гибели опухолевых клеток, а следовательно, и к развитию противоопухолевого иммунитета. При этом индуцируемые после локального или системного введения ЛПС провоспалительные цитокины и хемокины могут играть двойную роль: при внутриопухолевом введении ЛПС способствовать развитию противоопухолевого иммунитета, а при системном - в отсутствие мишеней для иммунной системы - положительно влиять на рост опухоли, устойчивость ее клеток и их метастатический потенциал.

Таким образом, имеющиеся данные указывают на двойственный эффект агонистов TLR на рост опухоли. Такое двоякое влияние ТLR говорит о более сложной функциональной роли TLR в биологии опухоли. Понятно, что подобная роль TLR выходит за рамки простой активации фактора NF-kB. Изучать влияние различных лигандов TLR на опухоль необходимо с учетом многих факторов, включая уровень экспрессии TLR; тип ткани, из которой происходит опухоль; микроокружение опухоли и многие другие. Системное исследование функций и роли ТLR на клетках опухоли может внести существенный вклад в разработку новых противоопухолевых средств с TLR-зависимым механизмом действия.

CnMCOK .HMTEPATYPH

1. Coussens L.M., Werb Z. // Nature. 2002. V. 420(6917). P. 860-867.

2. Mantovani A., Allavena P., Sica A., Balkwill F. // Nature. 2008. V. 454(7203). P. 436-444.

3. Okamoto T. // Endocr. Metab. Immune Disord. Drug. Targets.

2006. V. 6(4). P. 359-372

4. Thomas H.G., Han J.H., Balentien E., et al. // Methods Enzy-mol. 1991. V. 198. P. 373-383.

5. Kleeff J., Kusama T., Rossi D.L. // Int. J. Cancer. 1999. V. 81.

6. Deveraux Q.L., Schendel S.L., Reed J.C. // Cardiol. Clin. 2001.

V. 19(1). P. 57-74.

7. Dong Z., Wang J.Z., Yu F., Venkatachalam M.A. // Am. J. Pathol. 2003. V. 163(2). P. 663-671.

8. Bartsch H., Nair J. // Langenbecks Arch. Surg. 2006.

V. 391(5). P. 499-510.

9. Moser B., Willimann K. // Ann. Rheum. Dis. 2004. V. 63 Suppl 2. P. 84-89.

10. Rasmussen S.B., Reinert L.S., Paludan S.R. // APMIS. 2009. V. 117(5-6). P. 323-337.

11. Palm N.W., Medzhitov R. // Immunol. Rev. 2009. V. 227(1).

12. Zeromski J., Mozer-Lisewska I., Kaczmarek M. // Cancer Microenviron. 2008. V. 1(1). P 37-42.

13. Jego G., Bataille R., Geffroy-Luseau A., et al. //

Leukemia. 2006. V. 20(6). P 1130-1137.

14. Seya T., Akazawa T., Uehori J., et al. // Anticancer Res.

2003. V. 23(6a). P. 4369-4376.

15. Grauer O.M., Molling J.W., Bennink E., et al. // J. Immunol. 2008. V. 15. P. 6720-6729.

16. Medzhitov R. // Nat. Rev. Immunol. 2001. V. 1(2). P 135-145.

17. Pasare C., Medzhitov R. // Nature. 2005. V. 438(7066).

18. Zasloff M. // Nature. 2002. V. 415(6870). P. 389-395.

19. Doyle S.E., O‘Connell R.M., Miranda G.A., et al. // J. Exp. Med. 2004. V. 5. P. 81-90.

20. Werling D., Hope J.C., Howard C.J., Jungi T.W. // Immunology. 2004. V. 111(1). P 41-52.

21. Nijhuis M.M., Pasterkamp G., Sluis N.I., et al. // J. Vasc. Res. 2007. V. 44(3). P 214-222.

22. Kaisho T., Akira S. // J. Allergy Clin. Immunol. 2006.

V. 117(5). P 979-988.

23. Salaun B., Romero P, Lebecque S. // Eur. J. Immunol. 2007. V. 37(12). P. 3311-3318.

24. Iwasaki A., Medzhitov R. // Nat. Immunol. 2004. V. 5(10).

25. Pasare C., Medzhitov R. // Adv. Exp. Med. Biol. 2005. V. 560.

26. Li M., Zhou Y., Feng G., Su S.B. // Curr. Mol. Med. 2009. V. 9(3).

27. Curtiss L.K., Tobias P.S. // J. Lipid. Res. 2009. V. 50 Suppl.

28. Krieg A.M. // J. Clin. Invest. 2007. V. 117. P. 1184-1194.

29. Chicoine M.R., Zahner M., Won E.K. // Neurosurgery. 2007.

V. 60. P. 372-381.

30. Harmey J.H., Bucana C.D., Lu W. // Int. J. Cancer. 2002.

V. 101. P. 415-422.

31. Huang B., Zhao J., Shen S. // Cancer. Res. 2007. V. 67.

32. Means T.K., Golenbock D.T., Fenton M.J. // Life Sci. 2000. V. 8. P. 241-258.

33. Diebold S.S. // Handb. Exp. Pharmacol. 2009. V. 188. P. 3-30.

34. West A.P., Koblansky A.A., Ghosh S.// Annu Rev. Cell. Dev. Biol.

2006. V. 22. P. 409-437.

35. Zhang Z., Schluesener H.J. // Cell Mol. Life Sci. 2006. V. 63(24).

36. O‘Neill L.A., Bowie A.G. // Nat. Rev. Immunol. 2007. V. 7(5).

37. Stockfleth E., Trefzer U., Garcia-Bartels C. // Br. J. Dermatol. 2003. V. 149 (Suppl. 66). P 53-56.

38. Nogueras S., Merino A., Ojeda R. // Heart. Circ. Physiol.

2008. V. 294. P 708-713.

39. Okamoto M., Oshikawa T., Tano T., et al. // J. Immunother.

2006. V. 29. P. 78-86.

40. D‘Agostini C., Pica F., Febbraro G., et al. // Int.

Immunopharmacol. 2005. V. 5(7-8). P. 1205-1212.

41. Morales A., Eidinger D., Bruce A.W. // J. Urol. 1976. V. 116.

42. Street S.E., Cretney E., Smyth M.J. // Blood. 2001. V. 1; 97(1).

43. Swann J.B., Hayakawa Y., Zerafa N., et al. // J. Immunol. 2007.

V. 15;178(12). P. 7540-7549.

45. Balkwill F., Coussens L.M. // Nature. 2004. V. 431. P. 405-406.

46. Robak P, Smolewski P., Robak T. // Leuk. Lymphoma. 2008. V. 49. P 1452-1462.

47. Pikarsky E., Porat R.M., Stein I., et al. // Nature. 2004. V. 431. P. 461-466.

48. Palayoor S.T., Youmell M.Y., Calderwood S.K., et al. // Oncogene. 1999. V. 18. P 7389-7394.

49. Griffin J.D. // Blood. 2001. V. 98. P. 2291.

50. Philip M., Rowley D.A., Schreiber H. // Semin. Cancer Biol.

2004. V. 14. P 433-439.

51. Swann J.B., Vesely M.D., Silva A., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. P. 652-656.

52. Щебляков Д.В., Логунов Д.Ю., Зубкова О.В. и др. // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 2008. № 4. С. 6-9.

53. Logunov D., Scheblyakov D., Zubkova O., et al. // Oncogene. 2008. V. 27. P. 4521-4531.

54. Kim S., Takahashi H., Lin W.W., et al. // Nature. 2009. V. 457. P. 102-106.

55. Luo J.L., Maeda S., Hsu L.C., et al. // Cancer Cell. 2004. V. 6.

56. Huang B., Zhao J., Li H. // Cancer Res. 2005. V. 65. P 50095014.

57. Kim W.Y., Lee J.W., Choi J.J., et al. // Int. J. Gynecol. Cancer. 2008. V. 18. P 300-305.

58. Droemann D., Albrecht D., Gerdes J., et al. // Respir. Res.

2005. V. 6. P. 1-6.

59. Ilvesaro J.M., Merrell M.A., Swain T.M., et al. // Prostate.

2007. V. 67. P. 774-781.

60. Lotze M.T., Zeh H.J., Rubartelli A., et al. // Immunol. Rev.

2007. V. 220. P. 60-81.

61. Ellerman J.E., Brown C.K., Vera M., et al. // Clin. Cancer Res.

2008. V. 13. P. 2836-2848.

62. Cabezon T., Celis J.E., Skibshoj I., et al. // Int. J. Cancer. 2007. V. 121. P. 1433-1444

63. Adams S., O‘Neill D.W., Nonaka D., et al. // J. Immunol. 2008. V. 181. P. 776-784.

64. Spaner D.E., Miller R.L., Mena J., et al. // Leuk. Lymphoma. 2005. V. 46. P. 935-939.

65. Dudek A.Z., Yunis C., Harrison L.I., et al. // Clin. Cancer Res.

2007. V. 13. P. 7119-7125.

66. Schmidt J., Welsch T., Jäger D., et al. // Br. J. Cancer. 2007.

V. 97. P. 598-604.

67. Karin M., Yamamoto Y., Wang Q.M. // Nat. Rev. Drug. 2004. V. 3. P 17-26.

Врождённый иммунитет - наиболее ранний защитный механизм как в эволюционном плане (он существует практически у всех многоклеточных), так и по времени ответа, развивающегося в первые часы и дни после проникновения чужеродного материала во внутреннюю среду, т.е. задолго до развития адаптивной иммунной реакции. Значительную часть патогенов инактивируют именно врождённые механизмы иммунитета, не доводя процесс до развития иммунного ответа с участием лимфоцитов. И только если механизмы врождённого иммунитета не справляются с проникающими в организм патогенами, в «игру» включаются лимфоциты. При этом адаптивный иммунный ответ невозможен без вовлечения механизмов врождённого иммунитета. Кроме того, врождённый иммунитет играет главную роль в удалении апоптотических и некротических клеток и реконструировании повреждённых органов. В механизмах врождённой защиты организма важнейшую роль играют первичные рецепторы для патогенов, система комплемента, фагоцитоз, эндогенные пептиды-антибиотики и факторы защиты от вирусов - интерфероны. Функции врождённого иммунитета схематично представлены на рис. 3-1.

РЕЦЕПТОРЫ РАСПОЗНАВАНИЯ «ЧУЖОГО»

На поверхности микроорганизмов присутствуют повторяющиеся молекулярные углеводные и липидные структуры, которые в подавляющем большинстве случаев отсутствуют на клетках организма хозяина. Особые рецепторы, распознающие этот «узор» на поверхности патогена, - PRR (Pattern Recognition Receptors - паттернраспознающие рецепторы) - позволяют клеткам врождённого иммунитета обнаруживать микробные клетки. В зависимости от локализации выделяют растворимые и мембранные формы PRR.

. Циркулирующие (растворимые) рецепторы для патогенов - белки сыворотки крови, синтезируемые печенью: липополисахаридсвя-

Рис. 3-1. Функции врождённого иммунитета. Обозначения: PAMP (PathogenAssociated Molecular Patterns) - молекулярные структуры микроорганизмов, HSP (Heat Shock Proteins) - белки теплового шока, TLR (Toll-Like Receptors), NLR (NOD-Like Receptors), RLR (RIG-Like Receptors) - клеточные рецепторы

зывающий белок (LBP - Lipopolysaccharide Binding Protein), компонент системы комплемента C1q и белки острой фазы MBL и С-реактивный белок (СРБ). Они непосредственно связывают микробные продукты в жидких средах организма и обеспечивают возможность их поглощения фагоцитами, т.е. являются опсонинами (от греч. opsonein - делающий вкусным). Кроме того, некоторые из них активируют систему комплемента.

- СРБ, связывая фосфорилхолин клеточных стенок ряда бактерий и одноклеточных грибов, опсонизирует их и активирует систему комплемента по классическому пути.

- MBL принадлежит к семейству коллектинов. Имея сродство к остаткам маннозы, экспонированным на поверхности многих микробных клеток, MBL запускает лектиновый путь активации комплемента.

- Белки сурфактанта лёгких - SP-A и SP-D принадлежат к тому же молекулярному семейству коллектинов, что и MBL. Они, вероятно, имеют значение в опсонизации (связывании антител с клеточной стенкой микроорганизма) лёгочного патогена - одноклеточного грибка Pneumocystis carinii.

. Мембранные рецепторы. Эти рецепторы расположены как на наружных, так и на внутренних мембранных структурах клеток.

- TLR (Toll-Like Receptor - Toll-подобный рецептор; т.е. сходный с Toll-рецептором дрозофилы). Одни из них непосредственно связывают продукты патогенов (рецепторы для маннозы макрофагов, TLR дендритных и других клеток), другие работают совместно с иными рецепторами: например, CD14 молекула на макрофагах связывает комплексы бактериального липополисахарида (ЛПС) с LBP, а TLR-4 вступает во взаимодействие с CD14 и передаёт соответствующий сигнал внутрь клетки. Всего у млекопитающих описано 13 различных вариантов TLR (у человека пока только 10).

. Цитоплазматические рецепторы:

- NOD-рецепторы (NOD1 и NOD2) находятся в цитозоле и состоят из трёх доменов: N-концевого CARD-домена, центрального NOD-домена (NOD - Nucleotide Oligomerization Domain - домен олигомеризации нуклеотидов) и C-концевого LRR-домена. Различие между этими рецепторами заключается в количестве CARD-доменов. Рецепторы NOD1 и NOD2 распознают мурамилпептиды - вещества, образующиеся после ферментативного гидролиза пептидогликана, входящего в состав клеточной стенки всех бактерий. NOD1 распознаёт мурамилпептиды с концевой мезодиаминопимелиновой кислотой (meso-DAP), которые образуются только из пептидогликана грамотрицательных бактерий. NOD2 распознаёт мурамилдипептиды (мурамилдипептид и гликозилированный мурамилдипептид) с концевым D-изоглутамином или D-глутаминовой кислотой, являющиеся результатом гидролиза пептидогликана как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Кроме того, NOD2 имеет сродство к мурамилпептидам с концевым L-лизином, которые есть только у грамположительных бактерий.

- RIG-подобные рецепторы (RLR, RIG-Like Receptors): RIG-I (Retinoic acid-Inducible Gene I ), MDA5 (Melanoma Differentiation-associated Antigen 5) и LGP2 (Laboratory of Genetics and Physiology 2).

Все три рецептора, кодируемые этими генами, имеют сходную химическую структуру и локализуются в цитозоле. Рецепторы RIG-I и MDA5 распознают вирусную РНК. Роль белка LGP2 пока неясна; возможно, он выполняет роль хеликазы, связываясь с двуцепочечной вирусной РНК, модифицирует её, что облегчает последующее распознавание с помощью RIG-I. RIG-I распознаёт односпиральную РНК с 5-трифосфатом, а также относительно короткие (<2000 пар оснований) двуспиральные РНК. MDA5 различает длинные (>2000 пар оснований) двуспиральные РНК. Таких структур в цитоплазме эукариотической клетки нет. Вклад RIG-I и MDA5 в распознавание конкретных вирусов зависит от того, образуют ли данные микроорганизмы соответствующие формы РНК.

ПРОВЕДЕНИЕ СИГНАЛОВ С TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Все TLR используют одинаковую принципиальную схему передачи активационного сигнала в ядро (рис. 3-2). После связывания с лигандом рецептор привлекает один или несколько адапторов (MyD88, TIRAP, TRAM, TRIF), которые обеспечивают передачу сигнала с рецептора на каскад серин-треониновых киназ. Последние вызывают активацию факторов транскрипции NF-kB (Nuclear Factor of к-chain B-lymphocytes), AP-1 (Activator Protein 1), IRF3, IRF5 и IRF7 (Interferon Regulatory Factor), которые транслоцируются в ядро и индуцируют экспрессию геновмишеней.

Все адапторы содержат TIR-домен и связываются с TIR-доменами TOLL-подобных рецепторов (Toll/Interleukin-1 Receptor, так же как рецептора для ИЛ-1) путём гомофильного взаимодействия. Все известные TOLL-подобные рецепторы, за исключением TLR3, передают сигнал через адаптор MyD88 (MyD88-зависимый путь). Связывание MyD88 с TLR1/2/6 и TLR4 происходит при помощи дополнительного адаптора TIRAP, который не требуется в случае TLR5, TLR7 и TLR9. В передаче сигнала с TLR3 адаптор MyD88 не участвует; вместо него используется TRIF (MyD88-независимый путь). TLR4 использует как MyD88зависимый, так и MyD88-независимый пути передачи сигнала. Однако связывание TLR4 с TRIF происходит при помощи дополнительного адаптора TRAM.

Рис. 3-2. Пути передачи сигналов с Toll-подобных рецепторов (TLR). Указанные на рисунке TLR3, TLR7, TLR9 - внутриклеточные эндосомальные рецепторы; TLR4 и TLR5 - мономерные рецепторы, встроенные в цитоплазматическую мембрану. Трансмембранные димеры: TLR2 с TLR1 или TLR2 с TLR6. Тип распознаваемого димерами лиганда зависит от их состава

MyD88-зависимый путь. Адаптор MyD88 состоит из N-концевого DD-домена (Death Domain - домен смерти) и С-концевого TIRдомена, связанного с рецептором с помощью гомофильного TIR- TIR взаимодействия. MyD88 привлекает киназы IRAK-4 (Interleukin-1 Receptor-Associated Kinase-4) и IRAK-1 через взаимодействие с их аналогичными DD-доменами. Это сопровождается их последовательным фосфорилированием и активацией. После этого IRAK-4 и IRAK-1 отделяются от рецептора и связываются с адаптером TRAF6, который, в свою очередь, привлекает киназу TAK1 и убиквитин-лигазный комплекс (на рис. 3-2 не показан), что приводит к активации TAK1. TAK1 активирует две группы мишеней:

. IκB-киназу (IKK), состоящую из субъединиц IKKα , IKKβ и IKKγ. В результате фактор транскрипции NF-kB освобождается от ингибирующего его белка IκB и транслоцируется в клеточное ядро;

Каскад митоген-активируемых протеинкиназ (MAP-киназ), способствующий активации факторов транскрипции группы AP-1. Состав AP-1 варьирует и зависит от типа активирующего сигнала. Основные его формы - гомодимеры c-Jun или гетеродимеры c-Jun и c-Fos.

Результатом активации обоих каскадов является индукция экспрессии антимикробных факторов и медиаторов воспаления, в том числе фактора некроза опухолей альфа ФНОа (TNFa), который, воздействуя на клетки аутокринно, вызывает экспрессию дополнительных генов. Кроме того, AP-1 инициирует транскрипцию генов, ответственных за пролиферацию, дифференцировку и регуляцию апоптоза.

MyD88-независимый путь. Передача сигнала происходит через адаптер TRIF или TRIF:TRAM и приводит к активации киназы TBK1, которая, в свою очередь, активирует фактор транскрипции IRF3. Последний индуцирует экспрессию интерферонов I типа, которые, как и ФНОа в MyDSS-зависимом пути, воздействуют на клетки аутокринно и активируют экспрессию дополнительных генов (interferon response genes). Активация различных сигнальных путей при стимуляции TLR, вероятно, обеспечивает направленность врождённой иммунной системы на борьбу с тем или иным типом инфекции.

Сравнительная характеристика врождённых и адаптивных механизмов резистентности приведена в табл. 3-1.

Существуют субпопуляции лимфоцитов со свойствами, «промежуточными» между таковыми неклонотипных механизмов врождённого иммунитета и клонотипных лимфоцитов с большим разнообразием рецепторов для антигенов. Они не пролиферируют после связывания антигена (т.е. экспансии клонов не происходит), но в них сразу индуцируется продукция эффекторных молекул. Ответ не слишком специфичен и наступает быстрее, чем «истинно лимфоцитарный», иммунная память не формируется. К таким лимфоцитам можно отнести:

Внутриэпителиальные γδT-лимфоциты с перестроенными генами, кодирующими TCR ограниченного разнообразия, связывают лиганды типа белков теплового шока, нетипичные нуклеотиды, фосфолипиды, MHC-IB;

B1-лимфоциты брюшной и плевральной полостей имеют перестроенные гены, кодирующие BCR ограниченного разнообразия, которые обладают широкой перекрёстной реактивностью с бактериальными антигенами.

ЕСТЕСТВЕННЫЕ КИЛЛЕРЫ

Особая субпопуляция лимфоцитов - естественные киллеры (NKклетки, натуральные киллеры). Они дифференцируются из общей лимфоидной клетки-предшественника и in vitro способны спонтанно, т.е. без предварительной иммунизации, убивать некоторые опухолевые, а также инфицированные вирусами клетки. NK-клетки являются большими гранулярными лимфоцитами, не экспрессирующими линейных маркёров Т- и В-клеток (CD3, CD19). В циркулирующей крови нормальные киллеры составляют около 15% всех мононуклеарных клеток, а в тканях локализованы в печени (большинство), красной пульпе селезёнки, слизистых оболочках (особенно репродуктивных органов).

Большинство NK-клеток содержит в цитоплазме азурофильные гранулы, где депонированы цитотоксические белки перфорин, гранзимы и гранулизин.

Главными функциями NK-клеток являются распознавание и элиминация клеток, инфицированных микроорганизмами, изменённых в результате злокачественного роста, либо опсонизированных IgGантителами, а также синтез цитокинов ИФНу, ФНОа, GM-CSF, ИЛ-8, ИЛ-5. In vitro при культивировании с ИЛ-2 NK-клетки приобретают высокий уровень цитолитической активности по отношению к широкому спектру мишеней, превращаясь в так называемые LAK-клетки.

Общая характеристика NK-клеток представлена на рис. 3-3. Главные маркёры NK-клеток - молекулы CD56 и CD16 (FcγRIII). CD16 является рецептором для Fc-фрагмента IgG. На NK-клетках имеются рецепторы для ИЛ-15 - ростового фактора NK-клеток, а также для ИЛ-21 - цитокина, усиливающего их активацию и цитолитическую активность. Важную роль играют молекулы адгезии, обеспечивающие контакт с другими клетками и межклеточным матриксом: VLA-5 способствует прилипанию к фибронектину; CD11a/CD18 и CD11b/CD18 обеспечивают присоединение к молекулам эндотелия ICAM-1 и ICAM-2 соответственно; VLA-4 - к молекуле эндотелия VCAM-I; CD31, молекула гомофильного взаимодействия, ответственна за диапедез (выхождение через сосудистую стенку в окружающую ткань) NK-клеток через эпителий; CD2, рецептор для эритроцитов барана, является молекулой адгезии, которая

Рис. 3-3. Общая характеристика NK-клеток. IL15R и IL21R - рецепторы для ИЛ-15 и ИЛ-21 соответственно

взаимодействует с LFA-3 (CD58) и инициирует взаимодействие NKклеток с другими лимфоцитами. Помимо CD2, на NK-клетках человека выявляются и некоторые другие маркёры Т-лимфоцитов, в частности CD7 и гомодимер CD8a, но не CD3 и TCR, что отличает их от NKTлимфоцитов.

По эффекторным функциям NK-клетки близки к T-лимфоцитам: они проявляют цитотоксическую активность в отношении клетокмишеней по тому же перфорин-гранзимовому механизму, что и ЦТЛ (см. рис. 1-4 и рис. 6-4), и продуцируют цитокины - ИФНγ, ФНО, GM-CSF, ИЛ-5, ИЛ-8.

Отличие естественных киллеров от T-лимфоцитов состоит в том, что у них отсутствует TCR и они распознают комплекс антиген-

MHC иным (не вполне ясным) способом. NK не формируют клетки иммунной памяти.

На NK-клетках человека есть рецепторы, относящиеся к семейству KIR (Killer-cell Immunoglobulin-like Receptors), способные связывать молекулы MHC-I собственных клеток. Однако эти рецепторы не активируют, а ингибируют киллерную функцию нормальных киллеров. Кроме того, на NK-клетках есть такие иммунорецепторы, как FcyR, и экспрессирована молекула CD8, имеющая сродство к

MHC-I.

На уровне ДНК гены KIR не перестраиваются, но на уровне первичного транскрипта происходит альтернативный сплайсинг, что обеспечивает определённое разнообразие вариантов этих рецепторов у каждой отдельной NK-клетки. На каждом нормальном киллере экспрессировано более одного варианта KIR.

.H.G. Ljunggren и K. Karre в 1990 г. сформулировали гипотезу «missing self» («отсутствие своего»), согласно которой NK-клетки распознают и убивают клетки своего организма с пониженной или нарушенной экспрессией молекул MHC-I. Поскольку субнормальная экспрессия MHC-I возникает в клетках при патологических процессах, например при вирусной инфекции, опухолевом перерождении, NK-клетки способны убивать инфицированные вирусами или перерождённые клетки собственного организма. Гипотеза «missing self» схематично представлена на рис. 3-4.

СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА

Комплемент - система сывороточных белков и нескольких белков клеточных мембран, выполняющих 3 важные функции: опсонизацию микроорганизмов для дальнейшего их фагоцитоза, инициацию сосудистых реакций воспаления и перфорацию мембран бактериальных и других клеток. Компоненты комплемента (табл. 3-2, 3-3) обозначают буквами латинского алфавита C, B и D с добавлением арабской цифры (номер компонента) и дополнительных строчных букв. Компоненты классического пути обозначают латинской буквой «С» и арабскими цифрами (C1, C2 ... C9), для субкомпонентов комплемента и продуктов расщепления к соответствующему обозначению добавляют строчные латинские буквы (C1q, C3b и т.д.). Активированные компоненты выделяют чертой над литерой, инактивированные компоненты - буквой «i» (например, iC3b).

Рис. 3-4. Гипотеза «missing self» (отсутствие своего). На рисунке представлены три типа взаимодействия NK-клеток с мишенями. На NK-клетках имеется два типа распознающих рецепторов: активационные и ингибиторные. Ингибиторные рецепторы различают молекулы MHC-I и угнетают сигнал от активационных рецепторов, которые, в свою очередь, определяют либо молекулы MHC-I (но с меньшей аффинностью, чем ингибиторные рецепторы), либо MHC-подобные молекулы: а - клетка-мишень не экспрессирует активационных лигандов, и лизиса не происходит; б - клетка-мишень экспрессирует активационные лиганды, но не экспрессирует MHC-I. Такая клетка подвергается лизису; в - клеткамишень содержит как молекулы MHC-I, так и активационные лиганды. Исход взаимодействия зависит от баланса сигналов, идущих от активационных и ингибиторных рецепторов NK-клеток

. Активация комплемента (рис. 3-5). В норме, когда внутренняя среда организма «стерильна» и патологического распада собственных тканей не происходит, уровень активности системы комплемента невысок. При появлении во внутренней среде микробных продуктов происходит активация системы комплемента. Она может происходить по трём путям: альтернативному, классическому и лектиновому.

- Альтернативный путь активации. Его инициируют непосредственно поверхностные молекулы клеток микроорганизмов [факторы альтернативного пути имеют буквенное обозначение: P (пропердин), B и D].

Рис. 3-5. Активация системы комплемента и образование мембраноатакующего комплекса. Пояснения см. в тексте, а также в табл. 3-2, 3-3. Активированные компоненты, согласно международному соглашению, надчёркнуты

◊ Из всех белков системы комплемента в сыворотке крови больше всего C3 - его концентрация в норме составляет 1,2 мг/мл. При этом всегда имеется небольшой, но значимый уровень спонтанного расщепления C3 с образованием C3a и C3b. Компонент C3b - опсонин, т.е. он способен ковалентно связываться как с поверхностными молекулами микроорганизмов, так и с рецепторами на фагоцитах. Кроме того, «осев» на поверхности клеток, C3b связывает фактор В. Тот, в свою очередь, становится субстратом для сывороточной сериновой протеазы - фактора D, который расщепляет его на фрагменты Ва и Bb. C3b и Bb образуют на поверхности микроорганизма активный комплекс, стабилизируемый пропердином (фактор Р).

◊ Комплекс C3b/Bb служит С3-конвертазой и значительно повышает уровень расщепления С3 по сравнению со спонтанным. Кроме того, после связывания с C3 он расщепляет C5 до фрагментов C5a и C5b. Малые фрагменты C5a (наиболее сильный) и C3a - анафилатоксины комплемента, т.е. медиаторы воспалительной реакции. Они создают условия для миграции фагоцитов в очаг воспаления, вызывают дегрануляцию тучных клеток, сокращение гладких мышц. C5a также вызывает повышение экспрессии на фагоцитах CR1 и CR3.

◊ С C5b начинается формирование «мембраноатакующего комплекса», вызывающего перфорацию мембраны клеток микроорганизмов и их лизис. Сначала образуется комплекс C5b/C6/ C7, встраивающийся в мембрану клетки. Одна из субъединиц компонента C8 - C8b - присоединяется к комплексу и катализирует полимеризацию 10-16 молекул C9. Этот полимер и формирует неспадающуюся пору в мембране, имеющую диаметр около 10 нм. В результате клетки становятся неспособными поддерживать осмотический баланс и лизируются.

- Классический и лектиновый пути сходны друг с другом и отличаются от альтернативного способом активации C3. Главной C3конвертазой классического и лектинового пути служит комплекс C4b/C2a, в котором протеазной активностью обладает C2a, а C4b ковалентно связывается с поверхностью клеток микроорганизмов. Примечательно, что белок C2 гомологичен фактору В, даже их гены расположены рядом в локусе MHC-III.

◊ При активации по лектиновому пути один из белков острой фазы - MBL - взаимодействует с маннозой на поверхности клеток микроорганизмов, а MBL-ассоциированная сериновая протеаза (MASP - Mannose-bindingprotein-Associated Serine Protease) катализирует активационное расщепление C4 и C2.

◊ Сериновой протеазой классического пути служит C1s, одна из субъединиц комплекса C1qr 2 s 2 . Она активируется, когда по крайней мере 2 субъединицы C1q связываются с комплексом антиген-антитело. Таким образом, классический путь активации комплемента связывает врождённый и адаптивный иммунитет.

. Рецепторы компонентов комплемента. Известно 5 типов рецепторов для компонентов комплемента (CR - Complement Receptor) на различных клетках организма.

CR1 экспрессирован на макрофагах, нейтрофилах и эритроцитах. Он связывает C3b и C4b и при наличии других стимулов к фагоцитозу (связывания комплексов антиген-антитело через FcyR или при воздействии ИФНу - продукта активированных T-лимфоцитов) оказывает пермиссивное действие на фагоциты. CR1 эритроцитов через C4b и C3b связывает растворимые иммунные комплексы и доставляет их к макрофагам селезёнки и печени, обеспечивая тем самым клиренс крови от иммунных комплексов. При нарушении этого механизма иммунные комплексы выпадают в осадок - прежде всего в базальных мембранах сосудов клубочков почек (CR1 есть и на подоцитах клубочков почек), приводя к развитию гломерулонефрита.

CR2 B-лимфоцитов связывает продукты деградации C3 - C3d и iC3b. Это в 10 000-100 000 раз увеличивает восприимчивость B-лимфоцита к своему антигену. Эту же мембранную молекулу - CR2 - использует в качестве своего рецептора вирус Эпштейна-Барр - возбудитель инфекционного мононуклеоза.

CR3 и CR4 также связывают iC3b, который, как и активная форма C3b, служит опсонином. В случае если CR3 уже связался с растворимыми полисахаридами типа бета-глюканов, связывания iC3b с CR3 самого по себе достаточно для стимуляции фагоцитоза.

C5aR состоит из семи доменов, пенетрирующих мембрану клетки. Такая структура характерна для рецепторов, связанных с G-белками (белки, способные связывать гуаниновые нуклеотиды, в том числе ГТФ).

. Защита собственных клеток. Собственные клетки организма защищены от деструктивных воздействий активного комплемента благодаря так называемым регуляторным белкам системы комплемента.

- C1 -ингибитор (C1inh) разрушает связь C1q с C1r2s2, тем самым ограничивая время, в течение которого C1s катализирует активационное расщепление C4 и C2. Кроме того, C1inh ограничивает спонтанную активацию C1 в плазме крови. При генетическом дефекте dinh развивается наследственный ангионевротический отёк. Его патогенез состоит в хронически повышенной спонтанной активации системы комплемента и избыточном накоплении анафилактинов (C3a и С5а), вызывающих отёки. Заболевание лечат заместительной терапией препаратом dinh.

- C4 -связывающий белок - C4BP (C4-Binding Protein) связывает C4b, предотвращая взаимодействие C4b и С2а.

- DAF (Decay-Accelerating Factor - фактор, ускоряющий деградацию, CD55) ингибирует конвертазы классического и альтернативного путей активации комплемента, блокируя формирование мембраноатакующего комплекса.

- Фактор H (растворимый) вытесняет фактор В из комплекса с C3b.

- Фактор I (сывороточная протеаза) расщепляет C3b на C3dg и iC3b, а C4b - на C4c и C4d.

- Мембранный кофакторный белок MCP (Membrane Cofactor Protein, CD46) связывает C3b и C4b, делая их доступными для фактора I.

- Протектин (CD59). Связывается с C5b678 и предотвращает последующее связывание и полимеризацию С9, блокируя тем самым образование мембраноатакующего комплекса. При наследственном дефекте протектина или DAF развивается пароксизмальная ночная гемоглобинурия. У таких больных эпизодически возникают приступы внутрисосудистого лизиса собственных эритроцитов активированным комплементом и происходит экскреция гемоглобина почками.

ФАГОЦИТОЗ

Фагоцитоз - особый процесс поглощения клеткой крупных макромолекулярных комплексов или корпускулярных структур. «Профессиональные» фагоциты у млекопитающих - два типа дифференцированных клеток - нейтрофилы и макрофаги, которые созревают в костном мозге из СКК и имеют общую промежуточную клетку-предшественник. Сам термин «фагоцитоз» принадлежит И.И. Мечникову, который описал клетки, участвующие в фагоцитозе (нейтрофилы и макрофаги), и основные стадии фагоцитарного процесса: хемотаксис, поглощение, переваривание.

Нейтрофилы составляют значительную часть лейкоцитов периферической крови - 60-70%, или 2,5-7,5х10 9 клеток в 1 л крови. Нейтрофилы формируются в костном мозге, являясь основным продуктом миелоидного кроветворения. Они покидают костный мозг на предпоследней стадии развития - палочкоядерной форме, или на последней - сегментоядерной. Зрелый нейтрофил циркулирует 8-10 ч и поступает в ткани. Общая продолжительность жизни нейтрофила -

2-3 сут. В норме нейтрофилы не выходят из сосудов в периферические ткани, но они первыми мигрируют (т.е. подвергаются экстравазации) в очаг воспаления за счёт быстрой экспрессии молекул адгезии - VLA-4 (лиганд на эндотелии - VCAM-1) и интегрина CD11b/CD18 (лиганд на эндотелии - ICAM-1). На их наружной мембране выявлены эксклюзивные маркёры - CD66а и CD66d (раково-эмбриональные антигены). На рисунке 3-6 представлено участие нейтрофилов в фагоцитозе (миграция, поглощение, дегрануляция, внутриклеточный киллинг, деградация, экзоцитоз и апоптоз) и основные процессы, происходящие в этих клетках при активации (хемокинами, цитокинами и микробными веществами, в частности РАМР) - дегрануляция, образование активных форм кислорода и синтез цитокинов и хемокинов. Апоптоз нейрофилов и их фагоцитоз макрофагами можно рассматривать как важную составную часть воспалительного процесса, так как своевременное их удаление препятствует деструктивному действию их ферментов и различных молекул на окружающие клетки и ткани.

Рис. 3-6. Основные процессы, происходящие в нейтрофилах (НФ) при их активации и фагоцитозе

Моноциты и макрофаги. Моноциты являются «промежуточной формой», в крови их 5-10% от общего числа лейкоцитов. Их назначение - стать оседлыми макрофагами в тканях (рис. 3-7). Макрофаги локализуются в определённых участках лимфоидной ткани: медуллярных тяжах лимфатических узлов, красной и белой пульпы селезёнки. Клетки, производные моноцитов, присутствуют практически во всех нелимфоидных органах: клетки Купфера в печени, микроглия нервной системы, альвеолярные макрофаги, клетки Лангерганса кожи, остеокласты, макрофаги слизистых оболочек и серозных полостей, интерстициальной ткани сердца, поджелудочной железы, мезангиальные клетки почек (на рисунке не показаны). Макрофаги способствуют поддержанию гомеостаза, очищая организм от стареющих и апоптотических клеток, восстанавливая ткани после инфекции и травмы. Макрофаги

Рис. 3-7. Гетерогенность клеток, происходящих от моноцитов. Тканевые макрофаги (МФ) и дендритные клетки (ДК) происходят от моноцитов (МН) периферической крови

слизистых оболочек играют ведущую роль в защите организма. Для реализации этой функции они имеют набор распознающих рецепторов, кислородозависимые и кислородонезависимые механизмы киллинга микроорганизмов. Существенную роль в защите организма от инфекции играют макрофаги альвеолярные и слизистой оболочки кишечника. Первые «работают» в относительно бедной опсонинами среде, поэтому они экспрессируют большое количество паттернраспознающих рецепторов, включая скавенджер-рецепторы, маннозные рецепторы, β-глюканспецифические рецепторы, дектин-1 и др. При микробной инфекции в очаг проникновения микробов дополнительно мигрирует большое число воспалительных моноцитов, способных дифференцироваться в различные клеточные линии в зависимости от цитокинового окружения.

Рецепторы мембраны макрофагов

.CD115 (CSF-1R) - рецептор для моноцитарного колониестимулирующего фактора (M-CSF). Присутствует также на мембране полипотентной клетки-предшественника гранулоцитов и моноцитов и унипотентного предшественника моноцитов.

Рецепторы клеточной мембраны макрофагов, участвующие в процессе фагоцитоза.

-CD14 - рецептор для комплексов бактериальных ЛПС с белками сыворотки крови, связывающими ЛПС (LBP), а также липоарабиноманнана клеточной стенки микобактерий и липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий.

Рецепторы для фрагментов фосфолипидных мембран и других компонентов собственных повреждённых и умирающих клеток (рецепторы-«мусорщики», scavenger receptors). Таков, например, CD163 - рецептор для «старых» эритроцитов.

-Рецептор, связывающий маннозу (Macrophage Mannose Receptor). Присутствует на мембране тканевых макрофагов и через маннозосодержащие поверхностные структуры связывает бактерии, вирусы и грибки.

- Рецепторы для комплемента - CR3 (интегрин CD11b/CD18) и CR4 (интегрин CD11c/CD18). Помимо комплемента они связывают и ряд бактериальных продуктов: ЛПС, липофосфогликан Leishmania, гемагглютинин из филаментов Bordetella, поверхностные структуры дрожжевых клеток Candida и грибков Histoplasma.

- CD64 - рецептор для Fc-фрагментов IgG - FcγRI (Fcy-рецептор первого типа), обеспечивающий фагоцитоз макрофагами иммунных комплексов. Сила связывания FcyRI с иммуноглобулинами различных изотипов убывает в ряду: IgG3 > IgG1 > IgG4 >

IgG2.

Рецепторы, осуществляющие взаимодействие с лимфоцитами. Наряду с уже упомянутым CD64 к ним относят:

- рецепторы для цитокинов, вырабатываемых активированными лимфоцитами. Связывание с ИФНу и фактором некроза опухоли (ФНО) активирует макрофаг. Через рецептор для ИЛ-10 макрофаг, напротив, инактивируется;

- CD40, B7, MHC-II - мембранные молекулы для контактов с комплементарными мембранными молекулами лимфоцитов, т.е. для непосредственных межклеточных взаимодействий. У нейтрофилов такие рецепторы отсутствуют.

Последствия фагоцитоза. После того как фагоцит охватывает своей мембраной поглощаемый объект и заключает его в мембранную везикулу, называемую фагосомой, происходят следующие события.

.Расщепление фагоцитированного материала. Этот процесс идёт по одинаковым биохимическим механизмам во всех фагоцитах.

- Лизосомы - специальные внутриклеточные органеллы, содержащие набор гидролитических ферментов (кислых протеаз и гидролаз) с оптимумом pH порядка 4,0. В клетке лизосомы сливаются с фагосомами в фаголизосому, где и происходят реакции расщепления поглощённого материала.

- Ферментные системы. НАДФ-Н-оксидазы, супероксиддисмутаза, NO-синтазы, генерируют активные формы неорганических окислителей, участвующих в деструкции фагоцитированного объекта: пероксид водорода (Н 2 О 2), супероксид анион (О 2 -), синглетный кислород (1 O 2), радикал гидроксила (OH -), гипохлорид (OCl -), оксид азота (NO). Активация НАДФ-Н-оксидазы приводит к формированию так называемого «кислодородного взрыва» (рис. 3-8). Первичным продуктом «кислородного взрыва» является супероксидный анион О 2 - , который образуется при переносе НАДФ-H-оксидазой электрона на кислород. Супероксидный анион обладает слабым бактерицидным эффектом и является недолговечным. В результате реакции, катализируемой ферментом супероксидисмутазой (СОД), из двух молекул супероксидного аниона формируется перекись водорода, обла-

Рис. 3-8. Образование активных форм кислорода фагоцитами («кислородный взрыв»). Обозначения: NADPH-оксидаза - НАДФ-Н-оксидаза, NADP - НАДФ

дающая сильным микробицидным эффектом. При окислении хлоридов перекисью водорода в присутствии миелопероксидазы (МПО) образуется мощный цитотоксический агент - гипохлорная кислота HOCl, при её окислении супероксидным радикалом - гидроксильный радикал ОН, при окислении гипохлорит-иона перекисью водорода формируется синглетный кислород 1 О 2 , который является источником образования другого бактерицидного вещества - озона О 3 (на рис. не показан). При взаимодействии гипохлорной кислоты с аминогруппой

формируется микробицидное производное монохлорамина - R-NHCl.

.Секреция литических ферментов и окислительных радикалов в межклеточное пространство, где они также оказывают бактерицидное действие, но при этом поражают и собственные ткани. Нейтрофилы, помимо уже названных веществ, продуцируют и секретируют коллагеназу, катепсин G, желатиназу, эластазу и фосфолипазу A2.

.Образование и секреция цитокинов. Макрофаги и нейтрофилы, активированные продуктами микроорганизмов, начинают продуцировать цитокины и другие биологически активные медиаторы, инициирующие воспалительные реакции в очаге проникновения чужеродных агентов, подготавливая возможность развития адаптивного иммунного ответа.

Макрофаги продуцируют интерлейкины (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12); хемокин ИЛ-8; фактор некроза опухоли а (ФНОа); простагландины; лейкотриен В4 (LTB4); фактор, активирующий тромбоциты (ФАТ).

Нейтрофилы продуцируют ФНОа, ИЛ-12, хемокин ИЛ-8, LTB4

и ФАТ.

.Процессинг и презентация антигена - образование внутри клеток комплексов из продуктов расщепления фагоцитированного материала с собственными молекулами MHC-II и экспрессия этих комплексов на поверхности клетки для презентации антигенов T-лимфоцитам. Этот процесс осуществляется АПК: ДК, макрофагами и др.

ЭНДОГЕННЫЕ ПРОТИВОМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ - ПРИРОДНЫЕ АНТИБИОТИКИ

Пептиды, обладающие активностью антибиотиков, обнаружены в клетках многих эукариот - от растений до человека. Они образуются путём процессинга более крупных белков-предшественников и содержат 13-80 аминокислотных остатков. Изучение противомикробных пептидов в настоящее время - это одно из самых новых направлений исследований. В базе данных о пептидах-антибиотиках содержится свыше 1200 наименований.

Выделяют несколько групп пептидов-антибиотиков, из которых для человека важны так называемые дефензины - пептиды, содер-

жащие несколько цистеинов, между которыми сформированы 3 дисульфидные связи. α-Дефензины содержатся в гранулах нейтрофилов. Синтез β-дефензинов происходит в клетках покровных тканей - эпителия дыхательных путей и пищеварительного тракта (рис. 3-9). Главными источниками α-дефензинов I-IV типов являются нейтрофилы и макрофаги, α-дефензинов V-VI типов - клетки Пеннета кишечника; β-дефензинов - эндотелиоциты и кератиноциты. Дефензины являются многофункциональными агентами, играющими важную роль в процессе фагоцитоза и воспаления. Первый эффект - способность убивать бактерии, грибы, оболочечные вирусы. Он может реализовываться внутриклеточно (в фаголизосоме) и внеклеточно. В результате экзоцитоза довольно большие концентрации дефензинов могут накапливаться в воспалительном очаге. Дефензины индуцируют синтез ИЛ-8 и сами являются хемоаттрактантами. Они оказывают ряд не-

Рис. 3-9. Дефензины и их роль в процессе воспаления и фагоцитоза: а - источники дефензинов; б - эффекты дефензинов. Обозначения: МН - моноциты

специфических эффектов: стимулируют ангиогенез, заживление ран, индуцируют апоптоз и ингибируют синтез ФНОа, что важно на заключительных этапах воспаления. Вместе с тем дефензины стимулируют дифференцировку ДК.

Генетические дефекты пептидов-антибиотиков или необходимых для их функционирования кофакторов (например, ионных каналов, так как активность пептидов-антибиотиков «высокочувствительна» к ионной силе), вероятно, коррелируют с развитием прогредиентно текущей хронической патологии с инфекционными факторами в этиологии. Например, на сегодняшний день доказана связь развития муковисцидоза с мутацией гена регулятора мембранной проводимости CFTR, которая, возможно, определяет снижение активности β-дефензина в эпителии дыхательных путей.

ИНТЕРФЕРОНЫ ТИПА I

Как факторы противовирусной защиты интерфероны были открыты в 1957 г. А. Isaacs и J. Lindenmann. Выделяют интерфероны I, II и III типов. У человека тип I включает ИФНα, ИФНβ, ИФНκ, ИФНω, ИФНε. Главная роль во врождённой защите от вирусов принадлежит ИФНα (включает 13 членов) и ИФНβ (представлен одним членом). ИФНα и ИФНβ состоят из одной α-спиральной цепи из 165 и 166 аминокислотных остатков соответственно. Гомология между цепями составляет около 70%. К интерферонам типа II относится ИФНγ, а к интерферонам III типа - интерфероноподобные цитокины ИФН-λ1 (ИЛ-29), ИФН-λ2 (ИЛ-28A) и ИФН-λ3 (ИЛ-28B).

Считают, что основной источник интерферонов типа I в организме - плазмоцитоидные ДК. Интерфероны - небольшие белки, синтезируемые в инфицированных вирусом клетках. Индуктором синтеза интерферонов служат молекулы двуспиральной РНК. Двуспиральная РНК может быть геномной РНК вирусов или промежуточным продуктом транскрипции у ДНК-содержащих вирусов. В клетках млекопитающих собственных двуспиральных РНК нет.

Интерфероны типа I связываются со специфическими рецепторами на поверхности многих типов клеток иммунной системы и стимулируют противовирусный и в некоторых случаях противоопухолевый иммунный ответ. Подробнее эти действия описаны ниже и представлены на рис. 3-10.

Рис. 3-10. Функции ИФНα/β

Влияние ИФНα/β на дендритные клетки и В-лимфоциты (рис. 3-11)

ИФНα/β стимулируют превращение незрелых ДК (1) в зрелые (2). Это приводит к усилению ими синтеза цитокинов, хемокинов, экспрессии молекул МНС, особенно I класса, костимуляторных молекул, экспрессии и секреции главных факторов выживания и активации В2клеток - BAFF и APRIL. Эти лиганды, взаимодействуя с рецепторами В-клеток BAFFR и TACI соответственно, при участии цитокинов ИЛ10, ТФРβ и ИЛ-15, синтезируемых активированными ДК, вызывают в наивных В-клетках (3) переключение иммуноглобулиновых генов CμСγ и Cμ-Сα и их созревание в IgG(4)- и IgA(5)-плазмабласты. ИФНα/β вызывают активацию макрофагов с теми же последствиями, что и для ДК (на рис. 3-11 не показано). ИФНα/β являются необходимыми цитокинами для созревания и пролиферации В1-клеток - главных продуцентов естественных аутоантител в организме.

Влияние ИФН α/в на Т-клетки (рис. 3-11)

ИФНα/β способствуют выживанию и пролиферации CD4 + и CD8 + T-клеток. ИФНα/β усиливают цитотоксические свойства CD8 + Т-клеток, а также макрофагов и NK-клеток (на рис. 3-11 не показано). Вместе с тем ИФНα/β оказывают мощное антипролиферативное и проапоптозное действие, усиливая экспрессию проапоптотических молекул. Наличие одновременно пролиферативных и антипролиферативных свойств

Рис. 3-11. Влияние ИФНα/β на клетки иммунной системы. Обозначения: Blys и April - факторы выживания и активации В2-клеток BAFF и APRIL; BAFFR и TACI - рецепторы В-клеток. Этапы 1-5 описаны в тексте

связано, вероятно, с включением на различных этапах инфекционного процесса или адаптивного иммунного ответа различных регуляторных механизмов, определяющих чувствительность клетки к действию ИФНа/р.

Интерфероны типа I индуцируют ферменты, нарушающие репликативный цикл вирусов:

Олигоаденилатсинтетазу, полимеризующую АТФ в 2",5"-олигомеры (в норме нуклеотиды в нуклеиновых кислотах связаны по 3",5"). Аномальные 2",5"-олигомеры активируют эндорибонуклеазу, которая расщепляет их и заодно вирусные нуклеиновые кислоты;

Серинтреониновую киназу Р1 , фосфорилирующую фактор инициации синтеза белка эукариот eIF-2, что приводит к подавлению трансляции, в том числе и вирусных белков;

Белок MX - клеточный белок, необходимый для проявления резистентности клетки к размножению в ней вируса гриппа (по данным генетического нокаута гена mx).

ФАКТОРЫ ВРОЖДЁННОГО ИММУНИТЕТА

В табл. 3-4 перечислены различные факторы (молекулы) врождённой резистентности, относящиеся к разным функциональным классам (лектины, ЛПС-реактивные белки, активаторы комплемента, цитокины, липидные медиаторы, реактанты острой фазы, пентраксины).